不同抗癲癇藥物在戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型中的藥效學(xué)分析

摘要：目的探討卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉三種抗癲癇藥物在戊四唑（PTZ）誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型中的作用。方法在斑馬魚PTZ誘導(dǎo)癲癇模型中，選擇卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉三種抗癲癇藥物，并采用3個(gè)不同的濃度進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)和行為學(xué)分析。結(jié)果與溶劑組相比，卡馬西平300μM濃度組能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率分別為95.1%（P<0.01）；100 μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離反而比溶劑組增加130.1%（P<0.01）；30μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。與溶劑組相比，苯妥英鈉1000μM濃度組能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率為85.9%（P<0.01）；300μM濃度組也顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率為55.0%（P<0.01）；100μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。與溶劑組相比，丙戊酸鈉3000 μM濃度組能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率分別為62.6%（P<0.01）；1000、300μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論卡馬西平在300μM濃度時(shí)對(duì)癲癇發(fā)作有治療作用，而在100μM濃度時(shí)能加重癲癇發(fā)作；苯妥英鈉和丙戊酸鈉治療癲癇量效關(guān)系明確。

關(guān)鍵詞：卡馬西平；苯妥英鈉；丙戊酸鈉；斑馬魚；癲癇藥物篩選是新型藥物研發(fā)過程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，而篩選模型在藥物篩選過程中起著關(guān)鍵性作用[1，2]。面對(duì)大量的樣品，利用斑馬魚藥物篩選動(dòng)物模型能夠快速、準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)大量樣品活性評(píng)價(jià)，從而篩選到少量活性成分[3，4]。癲癇是慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征。以腦神經(jīng)元異常放電引起反復(fù)癇性發(fā)作為特征[5，6]?？R西平，苯妥英鈉和丙戊酸鈉是常用的抗癲癇藥物，能降低神經(jīng)細(xì)胞膜對(duì)Na+和Ca2+的通透性，從而降低細(xì)胞的興奮性，延長(zhǎng)不應(yīng)期，也可能增強(qiáng)GABA的突觸傳遞功能[7-9]。但三種藥物在PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇模型中的具體作用和機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立斑馬魚癲癇模型，探討卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉三種抗癲癇藥物的藥效分析，為臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對(duì)交配的方式進(jìn)行。每次交配準(zhǔn)備4~5對(duì)成年斑馬魚，平均每對(duì)能產(chǎn)200~300個(gè)胚胎。在受精后6h（即6 hpf）和24 hpf 對(duì)胚胎進(jìn)行清理（移除已死亡胚胎），并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。

受試樣品卡馬西平購自ACR ORGANICS 公司，批號(hào)AO272746。苯妥英鈉購自北京百靈威科技有限公司，批號(hào)GF01-FD。丙戊酸鈉購自美國sigma公司，批號(hào)109K1256。三種藥物分別用二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，批號(hào)1095515）配制成儲(chǔ)備液，-20℃保存。戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ）購自美國sigma公司，批號(hào)069K1245。解剖顯微鏡（SMZ645，Nikon公司）；48/96孔板（Nest Biotech）；行為分析儀（V3，ViewPoint Life Sciences公司）。

1.2方法在 28℃ 條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎（養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1L反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為 480~510 μS/cm；pH 為 6.9~7.2；硬度為 53.7~71.6 mg/L CaCO3）。選擇卡馬西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉和阿司匹林進(jìn)行抗癲癇藥效評(píng)價(jià)，其中阿司匹林作為陰性對(duì)照藥物。卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸鈉選擇3個(gè)濃度進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)，阿司匹林選擇10、30、100μM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待測(cè)藥物先處理1 h，再加入戊四唑，穩(wěn)定10 min后，利用運(yùn)動(dòng)/行為分析儀記錄60 min內(nèi)斑馬魚的運(yùn)動(dòng)情況。對(duì)斑馬魚的快速運(yùn)動(dòng)（V>20mm/sec）距離（D）進(jìn)行定量分析，計(jì)算藥物的抗癲癇治療效率，公式如下：癲癇治療效率（%）=(1 -■)×100%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均處理8尾斑馬魚。

1.3數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Mean±SE表示。用方差分析和Dunnett's T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表明具有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1卡馬西平的抗癲癇作用如圖1所示，在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，與溶劑組相比，卡馬西平300μM濃度組均能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率為分別為94.6%（P<0.01）和95.1%（P<0.01）；100 μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離反而比溶劑組分別增加103.3%（P<0.01）和130.1%（P<0.01）；30μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖1 卡馬西平抗癲癇藥效分析（mean±SE）

2.2苯妥英鈉的抗癲癇作用如圖2所示，在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，與溶劑組相比，苯妥英鈉1000μM濃度組均能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率分別為85.8%（P<0.01），85.9%（P<0.01）；300μM濃度組也顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率分別為39.5%（P<0.05），55.0%（P<0.01）；100μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖2苯妥英鈉抗癲癇藥效分析（mean±SE）

2.3丙戊酸鈉的抗癲癇作用如圖3所示，在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，與溶劑組相比，丙戊酸鈉3000μM濃度組均能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率分別為73%（P<0.01），62.6%（P<0.01）；1000、300μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖3 丙戊酸鈉抗癲癇藥效分析（mean±SE）

2.4阿司匹林的抗癲癇作用如圖4所示，在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，與溶劑組相比，阿司匹林10、30、100μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

圖4阿司匹林抗癲癇藥效分析（mean±SE）

3討論

實(shí)現(xiàn)不合格藥品的早期鑒定是現(xiàn)階段藥物研發(fā)工程的重大進(jìn)步，能加速藥物的研究和發(fā)展，并節(jié)省不斷增長(zhǎng)的開支。與哺乳動(dòng)物的高度相似性和不斷涌現(xiàn)的驗(yàn)證性藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，斑馬魚具有作為早期檢測(cè)藥物副作用模型的潛能[10]。在得到足夠驗(yàn)證的前提下，斑馬魚能夠在早期對(duì)成千上萬種藥物進(jìn)行快速的藥理安全性檢測(cè)，并在藥物篩選的關(guān)鍵性階段提供更好的幫助。在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，與溶劑組相比，卡馬西平300μM濃度組均能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率達(dá)到95.1%（P<0.01）；而100μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離反而比溶劑組增加達(dá)到130.1%（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)表明，卡馬西平在300μM濃度時(shí)對(duì)癲癇發(fā)作有治療作用，而在100μM濃度時(shí)能加重癲癇發(fā)作。這種現(xiàn)象讓我們需要思考基因表達(dá)與藥效的關(guān)聯(lián)性。同時(shí)卡馬西平加重癲癇失神發(fā)作是目前面臨的一個(gè)重要的臨床問題[10]，其機(jī)制尚未了解。這個(gè)現(xiàn)象與卡馬西平100μM在斑馬魚模型加重癲癇發(fā)作相一致。在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，苯妥英鈉1000μM濃度組均能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率達(dá)到85.9%（P< 0.01）；300μM濃度組也顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率達(dá)到55.0%（P <0.01）實(shí)驗(yàn)表明，苯妥英鈉治療癲癇量效關(guān)系明確，在300~1000μM濃度下能明顯改善癲癇癥。丙戊酸鈉3000μM濃度組均能顯著降低快速運(yùn)動(dòng)距離，癲癇治療效率達(dá)到73%（P<0.01）；1000、300μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。

實(shí)驗(yàn)表明，丙戊酸鈉治療癲癇量效關(guān)系明確，在3000μM濃度下能明顯改善癲癇癥狀。阿司匹林10、30、100μM濃度組快速運(yùn)動(dòng)距離與溶劑組相比均無明顯差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿司匹林在10~100μM濃度下對(duì)癲癇癥狀無改善作用。

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編輯/申磊