眼針療法干預(yù)MCAO模型大鼠抗氧化機(jī)制的研究

隨著人口老齡化的加重，中風(fēng)病發(fā)病率也隨之提高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康，探索中風(fēng)病發(fā)病機(jī)制及有效防治方法成為醫(yī)療工作者的首要任務(wù)。眼針是以祖國(guó)醫(yī)學(xué)臟腑經(jīng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)，根據(jù)眼球結(jié)膜上血管的形色變化，判斷性質(zhì)和部位，然后辨證針刺眼周特定穴位以治療全身疾病。根據(jù)后天八卦將眼周分為八個(gè)區(qū)，再與五臟六腑聯(lián)系起來(lái)，治療急性缺血性中風(fēng)時(shí)選取肝區(qū)、腎區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)以滋腎陰，清肝火，輸通上下焦氣機(jī)，活血通絡(luò)，使病得愈。

眼針對(duì)于缺血性中風(fēng)的療效已為眾人所承認(rèn)，但其作用機(jī)制尚不清楚，本研究擬采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方式，探索眼針對(duì)缺血性腦病的抗氧化作用機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK（遼）2008-0005。大鼠購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，1w后用于正式試驗(yàn)。大鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)干燥的環(huán)境中，室溫（18±2）℃，相對(duì)濕度45%。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12h晝夜節(jié)律，更換1次/d墊料，以保證大鼠生存環(huán)境潔凈。

大鼠體重均勻，均在（300±30）g范圍，毛色純白，富有光澤，活動(dòng)度適中，晚間活動(dòng)度增加，步態(tài)正常，行為學(xué)觀察未見(jiàn)異常大鼠。

1.2儀器設(shè)備 恒溫水浴振蕩器，SHA-B型，常州國(guó)華儀器設(shè)備廠(chǎng)生產(chǎn)。電子天平，JY5002型，0.01g～500g，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。電子天平，BS223S型，0.001g～220g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有統(tǒng)公司生產(chǎn)。微量移液器，美國(guó)熱電公司生產(chǎn)。紫外分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 MDA、SOD和GSH-PX測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物研究所。針灸針購(gòu)自成大方圓連鎖藥店（陵?yáng)|分店）。凍存管、吸頭、PCR管等耗材均購(gòu)自沈陽(yáng)博爾美生物有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的復(fù)制

2.1.1腦缺血再灌注大鼠模型的復(fù)制 參考馬賢德[1]等人發(fā)表的\"線(xiàn)栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究\"一文復(fù)制腦缺血再灌注大鼠模型。模型復(fù)制成功后，栓塞2h后，拔除栓塞線(xiàn)，進(jìn)行再灌注，再灌注時(shí)間為72h。

2.1.2假手術(shù)組動(dòng)物模型復(fù)制 假手術(shù)組手術(shù)方式同模型組，但不做栓塞，僅暴露出右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），然后逐層縫合即可。

2.2模型評(píng)價(jià) 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：參考Longa及Bederson的5分制法在動(dòng)物麻醉完全清醒后進(jìn)行評(píng)分[2]。0分：沒(méi)有神經(jīng)損傷；1分：對(duì)側(cè)前爪不能自由伸展；2分：向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分：向?qū)?cè)翻到；4分：行走不自由，意識(shí)模糊。分值越高，說(shuō)明動(dòng)物所表現(xiàn)出的問(wèn)題就越多。選取評(píng)分在1～3分的動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)因素施加

2.3.1實(shí)驗(yàn)分組 SPF級(jí)SD大白鼠60只，隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組（10只），假手術(shù)組（10只），MCAO模型對(duì)照組（20只），眼針治療組（20只）。

2.3.2各組干預(yù)因素施加 空白對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，不施加任何干預(yù)。假手術(shù)組，采用2.1.2中所述方法，復(fù)制假手術(shù)模型，模型復(fù)制后正常飼養(yǎng)，不做任何處理，模型復(fù)制后72h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。MCAO模型對(duì)照組，采用2.1.1中所述方法，復(fù)制腦缺血再灌注模型，模型復(fù)制后，正常飼養(yǎng)，不做任何處理，于再灌注72h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。眼針治療組，采用2.1.1中所述方法，進(jìn)行MCAO模型復(fù)制，再灌注即刻開(kāi)始進(jìn)行針刺治療，2次/d，連續(xù)3d。于再灌注72h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3.3眼針取穴及刺法 取13mm毫針，眼針組選定大鼠眶周2mm處進(jìn)行針刺，選擇的位置比對(duì)人體取穴措施[3，4]，選取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)，見(jiàn)圖1。采用針刺的手段：從眼眶邊緣2mm部位進(jìn)行平刺，左眼從順時(shí)針?lè)较颍ㄓ覀?cè)按逆時(shí)針?lè)较颍瑥脑撗▍^(qū)起始定位線(xiàn)向終止定位線(xiàn)進(jìn)針，進(jìn)行平刺操作，刺入真皮，達(dá)到皮下組織，進(jìn)針3mm，到終止定位線(xiàn)為止。留針20min，留針10min時(shí)用刮柄進(jìn)行刮針1次，刮針5下。

圖1 眼針定位示意圖

2.4指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1死亡率和神經(jīng)功能缺損評(píng)分觀測(cè) 各組大鼠模型復(fù)制成功后，進(jìn)行再灌注前參考\"神經(jīng)功能缺損評(píng)分\"標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，以評(píng)價(jià)模型復(fù)制成功情況。末次針灸后，清點(diǎn)各組大鼠數(shù)量，計(jì)算總死亡率，并對(duì)各組大鼠再次進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，統(tǒng)計(jì)分析組間差異。

2.4.2 各組大鼠血清中MDA、SOD和GSH-PX含量測(cè)定 各組大鼠末次針灸后，以10%水合氯醛（3.5ml/kg體重）腹腔麻醉，剖開(kāi)腹部，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，靜置1h后，2000轉(zhuǎn)/min，離心10min，分離血清備用。

采用比色法對(duì)各組大鼠血清中MDA、SOD、GSH-PX的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.5統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用\"x±s \"表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

3結(jié)果

3.1死亡率和神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果 空白對(duì)照組大鼠10只，除隨機(jī)抽取1只，處死進(jìn)行TTC染色外，無(wú)死亡大鼠，死亡率為0；假手術(shù)組大鼠10只，除隨機(jī)抽取1只，處死進(jìn)行TTC染色外，無(wú)死亡大鼠，死亡率為0；MCAO模型對(duì)照組大鼠20只，除隨機(jī)抽取1只進(jìn)行TTC染色，以及模型復(fù)制失敗大鼠2只，剩余18只，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，共計(jì)死亡7只，剩余11只，死亡率為38.9%；眼針治療組大鼠20只，除隨機(jī)抽取1只進(jìn)行TTC染色，以及模型復(fù)制失敗大鼠2只，剩余17只，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，共計(jì)死亡4只，剩余13只，死亡率為23.5%，見(jiàn)表1。

空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠末次針灸后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分，未見(jiàn)明顯神經(jīng)功能缺損體征。MCAO模型對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能缺損體征較為顯著，其評(píng)分與其他三組比較，均有顯著性差異（P<0.01），見(jiàn)表2。

3.2各組大鼠血清MDA、SOD和GSH-PX含量 各組大鼠血清中MDA含量檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，其余兩組大鼠血清中MDA含量均顯著升高（P<0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MCAO模型對(duì)照組比較，眼針治療組大鼠血清中MDA含量顯著減少（P<0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組大鼠血清中SOD和GSH-PX含量檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，其余兩組大鼠血清中SOD、GSH-PX含量顯著減少（P<0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MCAO模型對(duì)照組比較，眼針治療組大鼠血清中SOD、GSH-PX含量顯著增加（P<0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

4討論

自由基可使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，有損生物膜， 細(xì)胞的功能也將受到影響?？寡趸到y(tǒng)存在于機(jī)體內(nèi)，能夠相互排除自由基，使脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成減少，為了自由基在人體內(nèi)生成，以及人體內(nèi)自由基的清除處于動(dòng)態(tài)平衡。需借助于如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT） 等抗氧化酶，但在缺血再灌注條件下，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，使其生成與清除平衡失控，造成組織的損傷。通過(guò)氧化反應(yīng)造成細(xì)胞膜磷脂分子中的不飽和脂肪酸的過(guò)氧化是自由基， 導(dǎo)致磷脂結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變異，膜遭受一定程度的創(chuàng)傷，這樣導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能受到連鎖反應(yīng)的是生成的脂質(zhì)過(guò)氧化物經(jīng)過(guò)氧化酶催化生成MDA。清除機(jī)體自由基的主要類(lèi)是 超氧化物歧化酶（SOD）， 間接反映腦組織并且消除自由基的功能是靠SOD活性高低程度；腦組織中氧自由基含量的變化，及脂質(zhì)過(guò)氧化程度和腦細(xì)胞損傷程度由丙二醛（MDA）是脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，其含量間接反映。機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）。GSH-Px酶系的組成成分是硒，催化GSH變?yōu)镚SSG，是GSH-Px酶系的生成部分，它的作用能使有毒的過(guò)氧化物變成無(wú)毒的羥基化合物，而且還可以讓H2O2得到有效的分解，以此維護(hù)細(xì)胞膜的組織及能力免遭過(guò)氧化物的影響。硒半胱氨酸為GSH-Px的活性中心，反映機(jī)體硒水平靠其活力大小。催化GSH產(chǎn)生GSSG是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，而谷胱甘肽還原酶可以利用NADPH催化GSSG產(chǎn)生GSH，計(jì)算出谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力水平通過(guò)檢測(cè)NADPH的減少量即可。在上述反應(yīng)中，整個(gè)反應(yīng)體系的限速步驟是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，因此NADPH的減少量和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力線(xiàn)性有著十分密切的關(guān)系。

研究結(jié)果表明MCAO模型組大鼠血清中SOD、GSH-PX含量較正常組明顯降低，同時(shí)MDA含量較正常組明顯升高，此時(shí)大鼠亦出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀；經(jīng)眼針療法防治后腦缺血再灌注大鼠血清中SOD、GSH-PX含量呈現(xiàn)升高，同時(shí)MDA含量比模型組降低，大鼠的神經(jīng)功能缺損程度也減輕。結(jié)合以往的研究結(jié)果，腦缺血再灌注后，機(jī)體內(nèi)自由基的生成增加，使SOD、GSH-PX的含量降低，同時(shí)脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的量增多；由此腦組織的受損嚴(yán)重，大鼠表現(xiàn)出提尾時(shí)左側(cè)前肢難以伸直的形態(tài)， 行走是出現(xiàn)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，有時(shí)身體發(fā)生傾斜、最終倒下的狀況。針對(duì)這種癥狀采取針刺療法進(jìn)行防治后，可采取腦缺血再一次注射到大鼠血清中SOD、GSH-PX的含量的措施，以次讓多余的自由基得到清除，減少產(chǎn)生的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA， 大鼠神經(jīng)功能缺損的癥狀得到了減輕。

綜上所述，我們認(rèn)為\"眼針療法\"可有效抑制機(jī)體內(nèi)自由基氧化作用的相關(guān)途徑，從而發(fā)揮其抗腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用。

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