七氟醚對非去極化肌松藥與肌肉型乙酰膽堿受體作用的影響

摘要：目的 探討七氟醚對于非去極化肌松藥及肌肉型乙酰膽堿受體作用的影響。方法 取大鼠肌肉多聚腺嘌呤mRNA，并注入已去膜非洲爪蟾的卵母細(xì)胞之中，采用電壓鉗技術(shù)對電壓依賴性離子通道電流進(jìn)行記錄。常規(guī)建立七氟醚、維庫溴銨以及羅庫溴銨抑制乙酰膽堿產(chǎn)生的電流量曲線，并觀察加入抑制濃度為50%的七氟醚后，維庫溴銨以及羅庫溴銨抑制作用變化。結(jié)果 七氟醚、維庫溴銨以及羅庫溴銨均具有快速、可逆、穩(wěn)定以及濃度依賴性抑制作用，達(dá)到50%抑制率時的濃度分別為：823μmol/L、9.2nmol/L、33.4nmol/L。結(jié)論 七氟醚與非去極化肌松藥羅庫溴銨以及維庫溴銨能夠?qū)ν怀龊衲さ膎AChR產(chǎn)生協(xié)同作用，從而增加抑制效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：乙酰膽堿；七氟醚；非極化取肌松藥物

非去極化肌松藥在臨床中應(yīng)用廣泛，但麻醉中需要與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能對其作用具有一定的影響。七氟醚是臨床常用的氟化吸入麻醉藥，麻醉誘導(dǎo)迅速，可便于麻醉深度的調(diào)節(jié)，麻醉蘇醒較快[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚具有肌松作用，且能夠提高非去機(jī)化肌松藥所具有的神經(jīng)肌肉阻滯作用，但關(guān)于其作用機(jī)制目前尚未闡明，認(rèn)為可能與其肌肉型乙酰膽堿受體（nAChR）作用有關(guān)。本研究擬用具有大鼠nAChR模型進(jìn)行試驗(yàn)，研究七氟醚對于非去極化肌松藥及nAChR作用的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)動物為雌性成熟爪蟾，選自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所，年齡為1.5～2.0年，體質(zhì)量為200～250g。Wistar大鼠選自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2試劑與器材 應(yīng)用美國Promega公司研發(fā)的新磁珠技術(shù)進(jìn)行大鼠肌肉組織mRNA的提取，乙酰膽堿（Ach）、膠原酶（Ⅰ）、焦磷酸二乙酯（DEPC）以及HEPES均由Sigma公司提供，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。OC-725C型卵母雙電極電壓鉗儀選自美國Warner公司；微注射器選自美國WPI公司；記錄儀選擇CytoBench系統(tǒng)，由華中科技大學(xué)儀博公司提供。

1.3采集卵母細(xì)胞[2] 對爪蟾進(jìn)行冰浴麻醉30min，減下卵葉2～3個，并將其置于含有ND96培養(yǎng)液的醫(yī)用表面皿中。將單個卵母細(xì)胞分離出來，并置入無鈣的ND96培養(yǎng)液之中，以膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化，消化時間為1～2h，以將濾泡膜以及卵巢膜去除。選擇Ⅴ-Ⅵ期成熟卵母細(xì)胞置于ND96培養(yǎng)液之中，并于19℃下進(jìn)行恒溫恢復(fù)數(shù)小時。

1.4制備大鼠肌肉mRNA 處死成年大鼠，并迅速將其兩側(cè)小腿的三頭肌以及伸趾長肌去除，以預(yù)冷水連續(xù)洗滌2次，并進(jìn)行勻漿處理、探針退火、洗脫以及凍干等，以分離出mRNA+poly（A），置于-70℃條件下存儲。

1.5微量注射 向各個去膜卵母細(xì)胞之中注入濃度為1g/L的 mRNBA約50～100nl，并置于ND96溶液之中進(jìn)行恒溫浴2～3d，每天均應(yīng)換液并將壞死細(xì)胞去除。

1.6數(shù)據(jù)記錄 應(yīng)用常規(guī)雙電極電壓鉗進(jìn)行電生理記錄。以0.15mol/L的KCl溶液灌注電壓電極，以3mol/L的KCl溶液灌注電流電極，結(jié)束灌注后電壓電機(jī)和電流電極的阻抗分別為1-10MΩ和0.1～1MΩ左右，而鉗制電壓值為-60mV。在試驗(yàn)過程中，以Ringers液進(jìn)行灌流，并將灌流速度控制在3～5ml/min。合理調(diào)整蠕動泵泵速，以維持液面恒定并且無液體外流。在給藥前先進(jìn)行阻斷灌流，在給藥后再予以充分灌流，給藥量控制為2.5ml/次，并維持實(shí)驗(yàn)溫度在18℃～20℃，以CrtoBench進(jìn)行電流變化記錄。

2 結(jié)果

自大鼠肌肉組織之中提出出來的mRNA+poly（A）經(jīng)紫外分光光度儀測得A260/A280為1.9，此時蛋白質(zhì)已經(jīng)基本去除，所提取出的mRNA具有較好的純度，單位質(zhì)量內(nèi)提取的mRNA+poly（A）為（24±6.1）μg/g。由ACh能引發(fā)表達(dá)以后的卵母細(xì)胞能夠產(chǎn)生與之相對應(yīng)的膜電流，維庫溴銨與羅庫溴銨均可引起濃度依賴性、可逆性抑制ACh，而維庫溴銨對于膜電流的抑制作用較羅庫溴銨更強(qiáng)，濃度分別為9.2nmol/L、33.4nmol/L。七氟醚也能夠濃度依賴性地對ACh產(chǎn)生抑制作用，IC50濃度值為823μmol/L。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，單用應(yīng)用七氟醚時，其對于nAChR膜電流的抑制能力很弱，其達(dá)到相應(yīng)效應(yīng)時所需濃度為非去極化肌松藥的數(shù)百倍。將七氟醚與非去極化肌松藥聯(lián)合應(yīng)用時，臨床劑量內(nèi)的羅庫溴銨以及維庫溴銨抑制效應(yīng)顯著提高。nAChR是由不同亞基所組成的一種門控離子通道，具有四個亞單位區(qū)，可將其固定在突觸后膜之上，其中M2受體單位屬于親水性離子通道，該通道的內(nèi)部具有異氟醚結(jié)合位點(diǎn)[3]。相關(guān)研究資料顯示，在鈣通道應(yīng)用膜片鉗后，七氟醚能夠通過阻塞該通道而起到離子流抑制作用，可導(dǎo)致通道阻滯。將七氟醚聯(lián)合非去極化肌松藥聯(lián)合應(yīng)用所產(chǎn)生的協(xié)同作用可能是由于兩者所處區(qū)域不同，而與七氟醚相結(jié)合后構(gòu)象改變，從而引起拮抗劑親合力增強(qiáng)。提示七氟醚以及非去極化肌松藥能夠共同作用于機(jī)體突觸后膜，并產(chǎn)生協(xié)同作用。

綜上所述，在臨床濃度范圍之內(nèi)，七氟醚與非去極化肌松藥羅庫溴銨以及維庫溴銨能夠?qū)ν怀龊衲さ膎AChR產(chǎn)生共同作用，并在此位點(diǎn)產(chǎn)生協(xié)同作用，從而增加兩者的抑制效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉力，閔蘇，魏珂，等.七氟醚和異氟醚對不同濃度羅庫溴銨抑制乙酰膽堿受體內(nèi)向電流的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2011，27（1）：113-116.

[2]王小明.不同用藥對非去極化肌松藥的應(yīng)用對比研究[J].按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué)（上旬刊），2010，01（10）：14-15.

[3]李春蓮，七氟烷對順式阿曲庫銨和羅庫溴銨肌松作用的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2011，17（2）：165-167.

編輯/哈濤