蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織TGF—β1表達(dá)的影響研究楊思進(jìn)

摘要：目的 探討蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦缺血區(qū)TGF-β1表達(dá)的影響。方法 將120只健康雄性成年SD大鼠，體重（250～300）g，隨機(jī)分為六組（另30只備用）：假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組、步長(zhǎng)腦心通對(duì)照組，每組20只。以Zea longa法為標(biāo)準(zhǔn)制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型，假手術(shù)組只行正中切口，但不插入線栓。各用藥組均在動(dòng)物蘇醒后灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d（n=20）。術(shù)后7 d，心臟灌注固定，斷頭取腦，采用免疫組化方法檢測(cè)大腦皮層缺血區(qū)TGF-β1的蛋白表達(dá)。結(jié)果 蛭龍活血通瘀膠囊治療組大鼠腦組織缺血區(qū)TGF-β1表達(dá)較模型組明顯升高。結(jié)論 蛭龍活血通瘀膠囊可能通過神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)使缺血皮質(zhì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞TGF-β1表達(dá)顯著增加，促進(jìn)血管再生，修復(fù)損失腦組織，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：蛭龍活血通瘀膠囊；腦缺血；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth faetor-β1，TGF-β1）是一種普遍存在的細(xì)胞因子，其作用涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、炎癥和組織修復(fù)。近年來研究表明[1-2]，在缺血性腦損傷中TGF-β1有抗氧化、阻止細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞反應(yīng)的多種作用。蛭龍活血通瘀膠囊系由黃芪、水蛭、地龍、大血藤等組成的復(fù)方制劑，具有益氣活血化瘀通絡(luò)，祛風(fēng)的功效。我們觀察發(fā)現(xiàn)蛭龍活血通瘀膠囊能明顯促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與促進(jìn)缺血腦組織TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動(dòng)物 健康雄性成年SD大鼠150只，體重250～300 g，皮膚光滑潤(rùn)澤，呼吸道通暢，清潔級(jí)，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2試劑與藥物 TGF-β1單克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：G57121。磷酸鹽緩沖液（PBS）， 北京四正柏生物科技有限公司。DAB顯色試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司。蛭龍活血通瘀膠囊：由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院制劑室提供。批號(hào)：20121212；步長(zhǎng)腦心通膠囊：咸陽步長(zhǎng)制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：1209955。

1.2方法

1.2.1造模方法及動(dòng)物分組 參照Zea longa等[3-5]報(bào)道的線栓改良法造模，造模動(dòng)物在自然蘇醒后，參照Zealonga評(píng)分[3]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行5分制評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)損傷癥狀，0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，1分；向外側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分；行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒，3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷，4分。將術(shù)后24 h評(píng)分為1～3分的大鼠選入組，其余動(dòng)物剔除，并作隨機(jī)補(bǔ)充。用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即蛭龍活血通瘀膠囊高劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊中劑量組、蛭龍活血通瘀膠囊低劑量組、步長(zhǎng)腦心通膠囊對(duì)照組、腦缺血模型組和假手術(shù)組。

1.2.2藥物干預(yù) 蛭龍活血通瘀膠囊成人的臨床用藥量為4.8 g/d。按人體用量的5、10、20倍，成人體重按60 Kg計(jì)算，換算為動(dòng)物低、中、高劑量組的用藥量，分別為0.4 g/Kg/d、0.8 g/Kg/d、1.6 g/Kg/d；對(duì)照組按成人用量的10倍給藥，即0.8 g/Kg/d。各藥物干預(yù)組大鼠均給予等體積（3 mL）相應(yīng)濃度的藥物灌胃，假手術(shù)組及模型組大鼠給予等體積（3 mL）的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)7 d，并按體重調(diào)整給藥量。

1.2.3指標(biāo)采集及檢測(cè)方法

1.2.3.1免疫組化標(biāo)本制備及檢測(cè) 腦缺血7 d后，各組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/Kg）腹腔麻醉后，頸動(dòng)脈放血后，打開胸腔，暴露心臟，將灌注插管從心尖（左心室）部位插入直至左心室升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，先灌注20℃的0.9%生理鹽水200 mL，然后灌注4℃的4%多聚甲醛200 mL，灌注后，大鼠肺部、肝臟、以及全身肌肉變得僵硬，為灌注成功。迅速斷頭，剝?nèi)∧X組織，去除嗅球和小腦，在視交叉前后2 mm處冠狀切取腦組織，置于4℃的4%多聚甲醛固定48 h后，進(jìn)行常規(guī)脫水石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚約5 μm，每隔5張取1張，SP法Ang-1、Tie-2免疫組化染色，DAB顯色。任何被TGF-β1抗體染成棕黃色或棕褐色細(xì)胞均可視為陽性表達(dá)。

1.2.3.2計(jì)算機(jī)圖像分析 將切片于光鏡下放大400倍，采用Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，每例大鼠隨機(jī)選取3張切片，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)（被染成棕黃色或棕褐色為陽性細(xì)胞），每組所有照片的平均陽性細(xì)胞數(shù)代表該組的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異采用方差分析（One Way Aonva），兩兩對(duì)比采用t檢驗(yàn)。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

各組大鼠腦組織TGF-β1陽性表達(dá) TGF-β1在假手術(shù)組大鼠腦組織極少量陽性表達(dá)。模型組大鼠腦缺血區(qū)吞噬細(xì)胞陽性表達(dá)較假手術(shù)組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蛭龍高劑量組、中劑量組及低劑量組大鼠腦缺血區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和吞噬細(xì)胞陽性表達(dá)明顯增加，均強(qiáng)于模型組（P<0.01或P<0.05），以高劑量組尤為顯著，見表1，圖1。

3討論

TGF-β1是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，它可以參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能都具有重要的調(diào)節(jié)作用。TGF-β1在正常腦組織中的表達(dá)水平不高，一般只在大腦皮質(zhì)、腦膜、脈絡(luò)叢處可檢測(cè)到，但在病理?xiàng)l件下則明顯升高[6]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，蛭龍高劑量組、中劑量組及步長(zhǎng)對(duì)照組大鼠腦組織TGF-β1表達(dá)明顯升高（P<0.05），低劑量組大鼠腦組織TGF-β1表達(dá)有所升高，但無顯著性差異（P>0.05）。而TGF-β1在腦缺血后TGF-β1表達(dá)增加可通過以下途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用：①促進(jìn)血管生成：TGF-β1可以激活缺血半暗帶的血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)微血管的增長(zhǎng)，促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)的建立；②發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用：TGF-β1能降低Ca2+的濃度，維持Ca2+的體內(nèi)平衡，刺激bcl-2的產(chǎn)生，上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致TGF-β1在神經(jīng)元內(nèi)自身合成，同時(shí)TGF-β1可延長(zhǎng)神經(jīng)元的存活，抑制星形膠質(zhì)分化，刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放蛋白酶抑制劑；③抑制中性粒細(xì)胞的粘附：TGF-β1對(duì)致炎性細(xì)胞因子TNF-α具有明顯拮抗作用，并同時(shí)減少粘附受體表達(dá)來降低中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，具有免疫下調(diào)作用；④降低其他細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β的表達(dá)；⑤加強(qiáng)對(duì)損傷腦組織的修復(fù)：TGF-β1刺激細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生，抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性，從而促使ECM沉積， ECM的積聚對(duì)損傷后組織的修復(fù)有利。蛭龍活血通瘀膠囊治療組TGF-β1表達(dá)較模型組明顯增加，說明蛭龍活血通瘀膠囊可能通過神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)使缺血皮質(zhì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞TGF-β1表達(dá)顯著增加，促進(jìn)血管再生，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/張燕