燈盞細(xì)辛活血化瘀成分篩選

摘要：中藥活性成分的尋找和確定一直是中藥藥理學(xué)和中藥化學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。本文根據(jù)中藥化學(xué)成分與生物大分子發(fā)生親和反應(yīng)產(chǎn)生藥理效應(yīng)的原理，從數(shù)學(xué)角度提出尋找活性成分的方法。通過計(jì)算親和常數(shù)來衡量各化學(xué)成分的親和力，親和力較大者為可能的活性成分。隨后以燈盞細(xì)辛為例初步說明本方法應(yīng)用的可行性，并發(fā)現(xiàn)8個(gè)峰（成分）是作用于血小板可能的成分，其中7號(hào)峰被指認(rèn)為isochlorogenic acid B。本法的應(yīng)用有望為中藥活性成分的尋找提供新的策略。

關(guān)鍵詞：活性成分 親和力 指紋圖譜 HPLC 燈盞細(xì)辛

中藥（包括其復(fù)方）的作用具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特征。針對(duì)此特征，\"用'活性成分譜'思路破解中藥的安全性和有效性\"一文[1]相對(duì)完整地提出了中藥活性成分譜的思想，也基于親和原理對(duì)中藥活性成分譜提出了理論性探索方法。本文試圖從實(shí)踐的角度探討此問題的解決方式。由于中藥的有效性是化學(xué)成分決定的，因此先從單一化學(xué)成分的作用方式進(jìn)行分析。

1 單一活性成分作用的方式

中藥作用的本質(zhì)是化學(xué)成分與機(jī)體生物大分子相互作用的結(jié)果，作用的方式是通過親和現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)的。因此，某一活性分子的作用可以通過類似化學(xué)反應(yīng)的方式來反映，相互作用達(dá)到平衡后則有反應(yīng)式1和公式1。

（D表示游離狀態(tài)藥物分子，R表示未被結(jié)合的生物大分子，DR表示藥物分子-生物大分子復(fù)合物，E表示效應(yīng)）

KD表示解離常數(shù)，此處的單位是摩爾濃度，越小表示對(duì)形成復(fù)合物越有利。

公式2是分析化學(xué)藥物與某一具體生物大分子相互作用產(chǎn)生藥理效應(yīng)的基礎(chǔ)公式，適用于藥物分子與受體、酶等生物大分子進(jìn)行的反應(yīng)，其中KD值越小表示此化學(xué)成分與靶分子的親和力越強(qiáng)。實(shí)際上，公式2是米-孟方程（Michaelis-Menten Equation）的基礎(chǔ)公式，在此也是我們分析中藥活性成分的基礎(chǔ)公式。

2 中藥化學(xué)成分的檢測(cè)

先假定提取到的中藥成分都是可能的活性成分，因此中藥提取物的成分可以采用HPLC指紋圖譜的方式來反映，一個(gè)峰大體相當(dāng)于一個(gè)化學(xué)成分，峰高（或峰面積）的大小則反映該成分的含量（濃度）。

3 理論求解

3.1 必要的假設(shè) 由于中藥作用于機(jī)體的具體生物大分子尚未完全清楚，在采用公式2進(jìn)行求解之前，為了簡化問題，特提出必要的假設(shè)：①各中藥成分之間無明顯的相互作用；②各成分在與各自的靶分子相互作用時(shí)，無明顯的競爭抑制作用；③化學(xué)成分與靶分子的親和是雙分子反應(yīng)，不需要其它分子的介入；④只考慮各成分的直接作用，不考慮其代謝物可能參與的作用。

3.2 絕對(duì)求解 為了方便求解，可以將公式2進(jìn)行變換得公式3和公式4。

公式3就是米-孟方程的雙倒數(shù)變換（Lineweaver-Burk變換），而公式4就是Hanes變換。

為了求出[D]和[DR]，可以將不同濃度的中藥提取物與同一可能的靶細(xì)胞（組織、器官）勻漿液充分相互作用，然后通過指紋圖譜檢測(cè)出[D]（游離藥物）和[DT]（藥物總量），隨后根據(jù)公式5求出[DR]。也可以通過特殊方法直接檢測(cè)[D]和[DR]。

[DR]=[DT]-[D]（公式5）

當(dāng)獲得[DR]和[D]后，即可以根據(jù)公式3或公式4作圖計(jì)算出KD和[RT]。KD和[RT]是兩個(gè)重要的常數(shù)，其中KD反映某一中藥成分與靶分子間的親和力，越小表示此成分與生物大分子的親和力越強(qiáng)；[RT]是反映可能靶分子多少的參考值，值越大表明可能的靶分子越多。一般來講，KD較小的成分活性較強(qiáng)，值得關(guān)注。

在實(shí)際工作中，根據(jù)公式3和公式4求KD和RT要求至少用2個(gè)不同濃度的提取物進(jìn)行至少2次有效的親和實(shí)驗(yàn)（最好3次以上），這樣求的KD和RT較為可靠。然而絕對(duì)求解的前提是必須知道各指紋峰的分子量并能轉(zhuǎn)化為真實(shí)的摩爾濃度。這一點(diǎn)有時(shí)很難做到，因此可以進(jìn)行相對(duì)簡化的求解，即KD`和[RT]`。

3.3 相對(duì)的簡化求解 必須指出的是，公式3和公式4中的各分子濃度必須使用摩爾濃度，才能求得KD和[RT]的真實(shí)值；由于很多指紋峰很難直接指認(rèn)，在篩選活性成分時(shí)更不可能知道其分子量（W）信息和交換因子（f）信息，這時(shí)可以用峰高（或峰面積）代入公式3或公式4進(jìn)行計(jì)算，但求得的KD和[RT]會(huì)改變，對(duì)結(jié)果影響分析如下。

游離藥物[D]（摩爾濃度）、藥物總濃度[DT]和結(jié)合濃度[DR]與峰面積分子量存在公式6、公式7和公式8關(guān)系。

D為藥物的游離濃度，Ai表示某峰親和反應(yīng)平衡后測(cè)得的峰面積，f表示交換因子，W表示分子量

DT為藥物的總濃度，包括游離和結(jié)合；AT表示此峰未發(fā)生親和測(cè)得的峰面積，f和W的意義同公式6

Ai、AT、f和W的意義同公式6～7

將公式8代入[RT]=[R]+[DR]得公式9。

將相應(yīng)公式6～9代入公式1可以看出，因[RT]改變，KD也在改變。

因此，用峰高或峰面積求得KD實(shí)際上是調(diào)整后的KD，表示為KD`，相應(yīng)的[RT]為[RT]`。從以上公式可以看出，調(diào)整后的KD`和[RT]`與f和W存在一定的函數(shù)關(guān)系。

這時(shí)KD`和[RT]`對(duì)活性成分或某一成分靶組織（細(xì)胞）的判斷產(chǎn)生的影響有以下兩種情況：①如果在相同靶組織（細(xì)胞）進(jìn)行親和以判斷活性成分，存在一定的誤差，誤差大小與不同峰的f和W有關(guān)。②如果考察某個(gè)峰與不同靶組織（細(xì)胞）進(jìn)行親和判斷其最可能的靶組織（細(xì)胞），則誤差抵消。

在相對(duì)的簡化求解過程中，為了扣除非特異性親和帶來的干擾，消除f和W的影響，可以設(shè)立空白親和反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。即將中藥提取物與非特異性蛋白質(zhì)比如牛血清白蛋白（BSA）等也進(jìn)行親和反應(yīng)，也求得相應(yīng)的KD`和[RT]`。以此為參照，通過計(jì)算相對(duì)親和力（Ac）和相對(duì)RT（RRT）指標(biāo)，從理論上避免非特異性親和干擾，消除f和W的影響，其計(jì)算公式參見公式10和公式11。

AC越小表示親和力越大

RRT越大表示可能的靶分子越多

從公式10和公式11看出，由于采用相對(duì)值，因某些中藥化學(xué)成分的未知f和W帶來的誤差完全抵消。Ac小于1才有實(shí)際意義，且Ac越小表明親和力越大；RRT越大表明可能的靶分子越多。

必須指出的是，Ac和RRT均為無量綱，采用Ac和RRT進(jìn)行中藥活性成分譜分析時(shí)，Ac是要優(yōu)先考慮的。因?yàn)楦鶕?jù)前面的假設(shè)，親和力是作用的前提。

3.4 關(guān)于結(jié)合率 親和力反映了化學(xué)成分與可能靶分子之間的結(jié)合情況，直觀地來看，親和力越大，相結(jié)合狀態(tài)的化學(xué)成分也越多。因此可以根據(jù)結(jié)合率來簡單反映親和力大小，見公式12。

在公式3和公式4中，[DR]和[D]均是變量，因此公式12求出的結(jié)合率也會(huì)隨提取物濃度及靶分子量的變化而變化，因此結(jié)合率不是常數(shù)。

分析如下：

根據(jù)公式1，則有公式13；再將公式13進(jìn)行雙倒數(shù)再變換則有公式14。

公式14反映了結(jié)合率與[R]存在函數(shù)關(guān)系。當(dāng)[R]無窮大時(shí)（相當(dāng)于反應(yīng)體系藥物濃度無限?。?，則結(jié)合率接近于常數(shù)1；而[R]無窮小時(shí)（相當(dāng)于反應(yīng)體系的藥物濃度無限高），結(jié)合率趨向于常數(shù)0。

因此，結(jié)合率在衡量親和力大小時(shí)只具有有限的參考意義，適用于某些特殊情況。比如，當(dāng)中藥成分的含量較低，游離藥物或結(jié)合藥物太少，檢測(cè)誤差較大，導(dǎo)致可靠的[D]和[DR]數(shù)據(jù)不夠時(shí)，方可考慮使用結(jié)合率來進(jìn)行活性的粗略判斷。

4 燈盞細(xì)辛活血化瘀成分篩選

現(xiàn)以篩選燈盞細(xì)辛（Erigeron breviscapus （Vant.） Hand-Mazz）的活血化瘀活性成分譜為例來說明上述方法的應(yīng)用。由于燈盞細(xì)辛注射液的成分較多且其活血化瘀療效也得到了廣大臨床認(rèn)可，研究也表明燈盞細(xì)辛含有不需要生物轉(zhuǎn)化就能直接起作用的化學(xué)成分[5]，故本示例根據(jù)親和力篩選燈盞細(xì)辛直接的活血化瘀成分。

根據(jù)目前的研究成果，活血化瘀的可能靶組織（細(xì)胞、分子）主要是血液系統(tǒng)，包括血液、紅細(xì)胞、血小板、血漿成分等。因此將此中藥成分提取后（采用燈盞細(xì)辛注射液，云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號(hào)20090830）與兔血的全血、紅細(xì)胞、血漿、血清、血小板進(jìn)行親和反應(yīng)（以BSA為對(duì)照）。進(jìn)行親和反應(yīng)時(shí)，固定生物樣品的量，用梯度濃度的提取物與生物樣品進(jìn)行相互作用（4℃過夜），記錄反應(yīng)前的HPLC-UV指紋圖譜（其峰面積相當(dāng)于[DT]）。燈盞細(xì)辛注射液的指紋圖譜參見圖1，在當(dāng)前條件下，各指紋峰的檢測(cè)重復(fù)性較好（RSD<8%，n = 5）。反應(yīng)后，將體系用超濾法去蛋白操作再獲得去蛋白液的HPLC-UV指紋圖譜（其峰面積相當(dāng)于[D]）。[7]求出[DR]后，可以根據(jù)公式3可以計(jì)算出各峰的常數(shù)KD（KD`）和[RT]（[RT]`），并根據(jù)公式10和公式11求出相對(duì)親和常數(shù)（Ac）和相對(duì)RT（RRT），結(jié)果分別見表1和表2。

A：燈盞細(xì)辛注射液指紋圖譜；B：四個(gè)對(duì)照品的指紋圖譜（均購自中國藥品生物制品檢定所）色譜條件（液相色譜儀：日本島津公司 島津LC-2010C；檢測(cè)波長：330nm；柱溫：35℃；色譜柱：Phenomenex luna 5μ C18；洗脫梯度：10% A （0 min），17.5% A （20 min），17.5% A （40 min），45% A （80 min） and 45% A （90 min），A=乙腈，B=1%甲酸）[8]

No.3為綠原酸（chlorogenic acid），No. 5為咖啡酸（caffeic acid），No. 7為isochlorogenic acid B，No. 10為燈盞乙素（scutellarin）。

表1結(jié)果表明，指紋峰中（見圖1）的16個(gè)成分尚有部分Ac在當(dāng)前條件下未能測(cè)出，但能夠大體看出，燈盞細(xì)辛提取物對(duì)紅細(xì)胞的相對(duì)親和力均較小，而對(duì)血小板的親和力較大。對(duì)四個(gè)已知化合物而言，No.7 （isochorogenic acid B）和No.3和對(duì)全血、血漿、血清和血小板用的Ac值均較小，提示此成分與血小板有較強(qiáng)的親和力，可能具有較強(qiáng)的抗血小板活性。對(duì)照表2，No.7的血小板RRT較大，提示其作用靶點(diǎn)可能主要分布在血小板。實(shí)際上目前的文獻(xiàn)也表明No.3[9， 10]和No.7具有較好的抗血小板活性[11]。No.10（燈盞乙素）具有較強(qiáng)的活血化瘀活性[12]，但在燈盞細(xì)辛注射液中含量較低，本研究仍未能計(jì)算其Ac值。而其No.3（caffeic acid）的血小板活性較弱，只有在較大劑量才顯示出抗血小板活性。本研究計(jì)算的Ac和血小板活性大致相符。因此，根據(jù)表1和表2結(jié)果，本次篩選結(jié)果提示血小板是燈盞細(xì)辛活血化瘀作用的主要靶細(xì)胞，并篩選出8個(gè)峰是作用于血小板可能的成分，其中7號(hào)峰被指認(rèn)為isochlorogenic acid B。

5 問題與展望

5.1 理論性問題 本文前述的4項(xiàng)假設(shè)與實(shí)際情況具有一定差距。中藥化學(xué)成分較多，且很多化合物具有相似結(jié)構(gòu)和相似的化學(xué)性質(zhì)，這可能會(huì)在一定程度上干擾其它化學(xué)成分與靶分子的親和。

另外，親和力只是中藥化學(xué)成分發(fā)揮藥效的前提條件，親和力參數(shù)KD、KD`及Ac均沒有包含活性方向信息（比如對(duì)生物大分子的激活或抑制作用）。因此某個(gè)高親和力化學(xué)成分是否最終具有藥理活性還必須結(jié)合傳統(tǒng)藥理學(xué)模型進(jìn)行生物活性驗(yàn)證。

5.2 技術(shù)性問題 從示例可以看出，本方法要求指紋圖譜檢測(cè)方法有較高的靈敏性和穩(wěn)定性。由于條件限制，本示例采用的是HPLC-UV分析方法，靈敏度有限，導(dǎo)致許多Ac和RRT均未能求出。事實(shí)上，采用高靈敏度檢測(cè)方法比如HPLC-MASS，圖1中可辨認(rèn)的指紋峰可達(dá)50多個(gè)[8]。除UV檢測(cè)器外，盡管本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件與參考文獻(xiàn)[8]相同或接近，卻只能測(cè)出其中的16個(gè)峰。其次，在去除生物大分子的操作中，大分子是相對(duì)概念，徹底去除是相對(duì)的，因此在檢測(cè)中可能還會(huì)帶來干擾。

5.3 展望 采用親和原理和指紋圖譜技術(shù)來獲取中藥化學(xué)成分的活性信息是一個(gè)有益的嘗試。這將為中藥活性成分的研究提供新的思路，有望為指紋圖譜和生物活性建立起有效的內(nèi)在聯(lián)系。

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編輯/王海靜