絞股藍皂甙對人衰老皮膚成纖維細(xì)胞增殖調(diào)控的影響

摘要：目的 研究絞股藍皂甙對人衰老皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響及機制。方法 原代培養(yǎng)并建立人衰老皮膚成纖維細(xì)胞系，0、5、10、15 μg/mL絞股藍皂甙處理細(xì)胞，24、72、96 h后MTT檢測細(xì)胞增殖；72h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。結(jié)果 10、15 μg/mL絞股藍皂甙可以促進人衰老成纖維細(xì)胞增殖，使S期細(xì)胞數(shù)增多且呈濃度依賴。結(jié)論 絞股藍皂甙可以使S期細(xì)胞數(shù)增多且成纖維細(xì)胞增殖能力增強，具有延緩細(xì)胞衰老的作用。

關(guān)鍵詞：絞股藍皂甙；成纖維細(xì)胞；增殖；衰老；皮膚

衰老是發(fā)生在分子、細(xì)胞和整個機體水平的一個復(fù)雜的進行性的不可逆的過程。體外細(xì)胞模型不僅可以重現(xiàn)生物衰老過程，而且可以避免整體研究的諸多不便和干擾因素[1]。成纖維細(xì)胞是皮膚真皮中最主要的細(xì)胞成分，其結(jié)構(gòu)和功能的異常對皮膚衰老的發(fā)生發(fā)展有重要影響。絞股藍是葫蘆科草質(zhì)藤本植物，是五加科之外唯一含有與人參皂甙相似結(jié)構(gòu)皂甙的植物，其皂甙成分具有保護心腦血管、抗腦缺氧、抗腫瘤及抗衰老等藥理作用，并在治療高血脂癥、血管性癡呆、消化道潰瘍以及中風(fēng)等方面取得了一定的療效，因此引起國內(nèi)外眾多學(xué)者的重視[2]。本文觀察不同濃度絞股藍皂甙（Gyp）對衰老皮膚的成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，為絞股藍在抗衰老方面的進一步研究及應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1資料與方法

1.1實驗材料及主要試劑 皮膚標(biāo)本3例，取自施行眼袋切除術(shù)和倒睫矯正術(shù)的老年女性眼瞼周圍的正常皮膚，年齡55～60歲，由中國醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科提供。絞股藍皂甙，成都曼思特生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國GIBCO公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2方法

1.2.1建立細(xì)胞系及分組 皮膚標(biāo)本用膠原酶消化，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中植塊法原代培養(yǎng)，建立衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞系。實驗選用第3～6代細(xì)胞，分為兩組：空白組（A組）和給藥組（B、C、D組）。0、5、10、15 μg/mL絞股藍皂甙處理細(xì)胞，24、72、96 h后，MTT檢測細(xì)胞增殖情況；72 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.2制備絞股藍皂甙 取0.1 g絞股藍皂甙溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO），配成100 mg/mL的貯存液，DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋，使其終濃度分別為5、10、15 μg/mL。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔板上。分別加入絞股藍皂甙0、 5、10、15 μg/mL，同時根據(jù)DMSO的濃度做相應(yīng)溶劑對照，每例細(xì)胞的每一藥物濃度孔及相應(yīng)溶劑對照孔均做5復(fù)孔。另做1孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液和絞股藍皂甙。共做3塊培養(yǎng)板。培養(yǎng)24、72、96 h時各取出1塊培養(yǎng)板，MTT法檢測各孔吸光度值[3]。

1.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期[4] 胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌，棄上清，75%乙醇固定，4℃過夜，800 rpm離心5 min，棄上清，冰PBS 洗滌，棄上清，1 mL 冰PBS液重懸細(xì)胞，400目尼龍網(wǎng)過濾，加入10 mg/mL的RNase A 2 μL，37℃孵育45 min；加入1 mg/mL的PI染10 μL，4℃避光染色1h，流式細(xì)胞儀檢測分析，重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。方差齊時，行單因素方差分析，LSD方法進行多組間兩兩比較；方差不齊時，采用非參數(shù)分析進行多組間比較，Dunnett T3方法進行多組間兩兩比較[5]。

2結(jié)果

2.1濃度和時間對衰老成纖維細(xì)胞增殖的影響 加入不同濃度絞股藍皂甙，培養(yǎng)24 h、72 h、96 h可見，各組細(xì)胞均繼續(xù)生長，24～72 h，細(xì)胞生長較快，72～96 h細(xì)胞生長放緩。培養(yǎng)24 h、72 h，與A組比較，B組無促進細(xì)胞增殖作用，C組、D組表現(xiàn)為增殖促進（P<0.05），且D組的增殖促進作用更強（P<0.05）。培養(yǎng)96 h，呈飽和狀態(tài)，藥物濃度對細(xì)胞增殖作用無明顯差異，見圖1。

2.2濃度對衰老成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 與A組比較，B組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；C組、D組DNA合成期（S期）的細(xì)胞數(shù)均增高（P<0.05，P<0.01），且D組增高更顯著（P<0.05）。提示較高濃度的絞股藍皂甙使處于S期的細(xì)胞數(shù)增加，見表1。

3討論

皮膚衰老是內(nèi)源性和外源性因素（如紫外線、煙塵等）共同作用的結(jié)果，因此可以作為研究各種因素對衰老綜合作用的模型[6]。皮膚由表皮和真皮構(gòu)成，真皮的結(jié)構(gòu)和功能的改變是皮膚衰老多種臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)，成纖維細(xì)胞在其中的作用已被越來越多的實驗研究[7]所關(guān)注。

細(xì)胞的生命開始于產(chǎn)生它的母細(xì)胞的分裂，結(jié)束于它的子細(xì)胞的形成，或是細(xì)胞的自身死亡。細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個階段，間期又分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞在S期完成DNA的合成，同時合成與DNA組裝、構(gòu)成染色質(zhì)等有關(guān)的組蛋白和DNA復(fù)制所需要的酶。衰老時成纖維細(xì)胞在各細(xì)胞周期的細(xì)胞分布會發(fā)生改變，表現(xiàn)為明顯的間期阻滯，處于間期的細(xì)胞的比例隨時間逐漸提高[8]。本實驗證實，經(jīng)較高濃度絞股藍皂甙作用后，處于S期的細(xì)胞比例增高。提示處于DNA合成及其相關(guān)活動的細(xì)胞增多，絞股藍皂甙對人衰老皮膚成纖維細(xì)胞具有增殖促進作用。MTT檢測結(jié)果也驗證了這一點，且藥物作用的適宜時間為72 h。96 h無明顯作用可能與細(xì)胞生長空間受限，出現(xiàn)接觸抑制有關(guān)。

絞股藍皂甙是絞股藍中提取出來的藥效成分，多項實驗研究[9-11]表明其具有抑制腫瘤、抗氧化、增強免疫等藥理作用。絞股藍可以減輕氧化應(yīng)激[12]對自然衰老小鼠皮膚組織的損傷，延緩皮膚衰老。絞股藍總皂苷含藥血清可能通過抑制NF-κB信號通路[13]，抑制p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA表達[14]，延緩皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞光老化。本文將MTT比色法和流式細(xì)胞儀檢測法結(jié)合起來，以評價絞股藍皂甙對體外培養(yǎng)的人衰老皮膚成纖維細(xì)胞增殖情況的調(diào)控作用。實驗結(jié)論可為將絞股藍皂甙在細(xì)胞水平應(yīng)用于延緩皮膚衰老的相關(guān)研究提供技術(shù)支持，但具體機制及調(diào)控因素的作用應(yīng)需進一步的研究和探討。

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編輯/張燕