大腸埃希氏菌對喹諾酮類藥物的耐藥現(xiàn)狀及防治

摘要：喹諾酮類藥物（Quinolones，Qs）是一類合成廣譜抗菌藥，自20世紀(jì)60年代萘啶酸被運用于臨床醫(yī)學(xué)以后，同時喹諾酮類藥物的耐藥問題便接踵而至，這使得喹諾酮類藥物成為開發(fā)最活躍，更新?lián)Q代最迅速的藥物。由于其具有抗菌譜廣，抗菌活性強，與常用抗菌藥物無交叉耐藥，已成為臨床治療感染性疾病的主要藥物之一。然而，隨著喹諾酮類藥物在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床的廣泛、長期、大量盲目濫用，使得其耐藥性近年呈蔓延增長趨勢，耐藥程度越來越重，耐藥菌株越來越多。其中，大場桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性問題是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點。本文綜述了大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥現(xiàn)狀及特點，并分析了其耐藥機制，簡要綜述了減緩耐藥性的一些防治策略。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；喹諾酮類藥物；基因傳遞；耐藥機制

1 大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥現(xiàn)狀和特點

針對大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥趨勢日益嚴(yán)重的情況下，人們進(jìn)行了大量的調(diào)查及科研工作，并取得了一定成果，同時也揭示了大腸桿菌的嚴(yán)重耐藥所產(chǎn)生的不良后果。

1.1 耐藥現(xiàn)狀 喹諾酮類藥物在國內(nèi)90年代被廣泛使用，由于喹諾酮類藥物容易產(chǎn)生耐藥且作用機制相似，所以不同喹諾酮類藥物之間可能存在交叉耐藥。有關(guān)大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥調(diào)查和研究在國外開展得比較早。美國德克薩斯州休斯頓本.托比綜合醫(yī)院從1999～2004年從1700例患者中分離出21000株大腸桿菌，其中對氟喹諾酮類藥物不敏感大腸桿菌從1999的6%增加2004年的25% [1]。捷克斯洛伐克Zemkova M， Kotlarova J [2]等人做了一項關(guān)于尿路感染的大腸桿菌耐喹諾酮類藥物的實驗，從2001年到2006年從尿路感染的住院患者和門診患者中收集了11856株大腸桿菌并且測試了他們對喹諾酮類藥物的敏感性，結(jié)果顯示：住院患者中的耐藥大腸桿菌比例從2001年的2%增加到2006年的10%，門診患者耐藥大腸桿菌比例從1%增加到11%。

在獸醫(yī)臨床上，一相有關(guān)歐洲八國動物用三代喹諾酮類藥物\"馬波沙星\"的監(jiān)測研究表明，從1994～2001年，\"馬波沙星\"在家禽和動物的MIC90： 從1.275ug/ml增加到5.098ug/ml（P=0.0230）3[3]。西班牙Sabaté M 4[4] 等人，對分離出的85株大腸桿菌（43株，25株，14株，1株分別來源于雞、人、豬、牛的廢水），進(jìn)行遺傳系譜、致病島（pathogenicity islands，PAIs）、喹諾酮類藥物耐藥分析，結(jié)果顯示：人源性的耐氟喹諾酮類藥物大腸桿菌從雞傳遞給人的可能性要比人自身腸內(nèi)大腸桿菌因氟喹諾酮的應(yīng)用選擇出耐藥大腸桿菌的可能性要大，但同時有實驗表明禽類大腸桿菌耐藥性可能通過禽類制品食物鏈傳遞給人類[5，6]。

我國使用喹諾酮類抗菌藥物之初，大腸桿菌對喹諾酮類藥物敏感性極高，但隨著喹諾酮藥物的廣泛運用，各個地區(qū)都出現(xiàn)了耐藥性菌株的激增。北京醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離的大腸桿菌對環(huán)丙沙星耐藥菌株1993年為3.3%，1996年上升到44.2%，1998年高達(dá)62.8%。2006和2007年，復(fù)旦大學(xué)華山附屬醫(yī)院聯(lián)合國內(nèi)主要地區(qū)（北京、上海、浙江、廣州、武漢、重慶、甘肅、新疆）較有代表性的醫(yī)院從臨床分別分離出6072株和6527株大腸桿菌，06年對環(huán)丙沙星耐藥率為61.7%[7]，而07年產(chǎn)ELBL的E.coli耐藥率為71.8%，不產(chǎn)ELBL者為44.8%[8]。

我國獸醫(yī)臨床上的大量長期使用喹諾酮類藥物導(dǎo)致了嚴(yán)重耐藥的境況，有研究[9]利用藥敏實驗自動監(jiān)測系統(tǒng)（trek Diagnostic System，Westlake，OH）分析了71株雞源大腸桿菌分離菌株對9種喹諾酮類藥物的耐藥性，結(jié)果表明臨床分離菌株對沙拉沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、二氯沙星、單諾沙星、奧比沙星和萘定酸呈現(xiàn)很高的耐藥性，耐藥率分別為69%、69%、55%、76%、69%、76%和99%；對蓋特沙星和左氧氟沙星有輕度的耐藥性，耐藥率分別為11%和13%。在71株分離菌株中，只有1株沒有耐藥性，對3種以上藥物有耐藥性的菌株占74%（52/72），對6種以上藥物有耐藥性的菌株占70%（49/70），呈現(xiàn)多重耐藥性，多重耐藥性甚至可能通過使用抗生素的種類、時間和劑量來進(jìn)行調(diào)節(jié)。另外，趙春燕[10]報道， 20世紀(jì)90年代前、9O年代、9O年代以后（雞、豬）耐藥菌株百分比分別為： 28.73 %、43.19% 、53.47% ，說明大腸桿菌耐藥性逐漸增強，目前病原菌對大多數(shù)喹諾酮類藥的耐藥率達(dá)50% 以上。國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測中心收集的從1994～2001年常見菌種對環(huán)丙沙星耐藥率的變遷可以看出，國內(nèi)大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥率自1994 年開始一直維持在50%～60%左右[11]，而到了2000年～2003年從全國11個省份分離出家禽和豬源性大腸桿菌393株，藥敏實驗表明他們對環(huán)丙沙星的耐藥率已經(jīng)達(dá)到了74.8%[12]。

綜合以上可以看出，雖然我國90年代以后才開始大量使用喹諾酮類藥物，但國內(nèi)大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物耐藥率與國外相比則后來居上，那么人源性大腸桿菌對喹諾酮類藥物的高水平耐藥率，是否和喹諾酮藥物在獸醫(yī)臨床的大量長期的使用有關(guān)，耐藥基因是否可能通過動物種群傳遞給人，有關(guān)研究提出了這個可能性 [5，13，14]。

1.2 大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥特點 美國休斯頓本.托比綜合醫(yī)院[1]從用藥時間，患者年齡，菌株的標(biāo)本來源等方面分析大腸桿菌的耐藥性，有如下特點：①用藥時間越長，大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物不敏感率增加，通過二元回歸分析（P<0.001），耐藥率以1.024倍/月的速度遞增。②隨年齡的增加耐藥率增加，在年齡>65歲患者中耐藥株占到29%，而<65歲者為13%，兩者有明顯差異（P<0.001）。③住院患者的耐藥率高于門診患者。④ 痰樣本分離的菌株耐藥率最高。

2 大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制

通過近年來的研究表明，大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性產(chǎn)生主要有以下相關(guān)耐藥機制。

2.1 喹諾酮類藥物作用靶位的改變 喹諾酮類藥物的作用靶位主要在細(xì)菌的DNA回旋酶（gyrase）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（TOPOⅣ）。DNA 回旋酶是由2個A亞基（97-kDa）和2個B亞基（90-kDa）構(gòu)成的四聚體，分別由gyrA 和gyrB基因編碼。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是由2個C亞基和2個E亞基組成的四聚體，分別由parC和parE基因編碼。兩種酶作用機制相似，回旋酶作用DNA產(chǎn)生負(fù)超螺旋，并可以切斷和連接DNA環(huán)。TOPOⅣ同樣能松解正、負(fù)超螺旋，在切斷DNA環(huán)功能上要優(yōu)于DNA 回旋酶。這兩種酶一起作用于DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù) [15]。喹諾酮類藥物與酶-DAN結(jié)合為藥物-酶-DAN復(fù)合物，這種復(fù)合物是藥物作用的基礎(chǔ)，它干擾了TOPOⅣ和DNA回旋酶的活性，干擾阻止DNA環(huán)的修復(fù)從而抑制DNA 的合成起作用 [16]。gyrB基因和parC基因突變可促進(jìn)gyrA基因突變，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。在抑制與反抑制的較量中，細(xì)菌編碼回旋酶的基因突變，亦然成了耐藥株的來源。喹諾酮耐藥決定區(qū)（quinolone resistance determiningregion，QNDR）即是A亞基或C亞基涉及關(guān)于氨基酸替代導(dǎo)致耐藥的區(qū)域，QNDR多位于與DNA結(jié)合的酶表面。對大腸桿菌而言，它的DNA回旋酶氨基酸替代區(qū)域位于第51-106位點之間的氨基酸，其中，發(fā)生突變最多的是83（Ser→Leu）和87（Asp→Gly）位氨基酸。這種突變導(dǎo)致了喹諾酮類藥物與酶-DAN親和力的降低，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。

2.2 大腸桿菌對喹諾酮藥物的主動外排 根據(jù)能量來源的不同，主動外排系統(tǒng)可分為質(zhì)子依賴型多藥耐藥泵和ATP依賴型多藥耐藥泵2種類型，大腸埃希菌以前者為主。RND家族是大腸埃希菌產(chǎn)生多藥耐藥性最重要的家族之一，其中AcrAB-TolC系統(tǒng)為主要代表，是目前耐藥研究中的熱點，屬于質(zhì)子依賴型，能夠產(chǎn)生對多種抗菌藥的高水平的多重耐藥，該系統(tǒng)主要由細(xì)胞內(nèi)膜泵（AcrB）通過跨膜融合蛋白（AcrA）與外膜的排除泵（TolC）連接而組成，它有較寬的作用底物范圍，包括了喹諾酮類、氯霉素、四環(huán)素等多種抗生素、染料和去污劑等。用基因敲除技術(shù)人工去除acrAB或tolC基因時，大腸埃希菌對上述藥物的敏感性明顯增加。目前還發(fā)現(xiàn)，藥物分子外排主要和H 相偶聯(lián)，它們構(gòu)成一個反向轉(zhuǎn)運蛋白，通道開放后，H﹢由于濃度梯度內(nèi)流，藥物分子隨即外排[17]。

2.3外膜通透性下降 有研究[18]表明，大腸桿菌的外膜在耐藥過程中起著重要的作用。 大腸桿菌的外膜對許多抗菌藥物的通透性較低，形成一道天然的屏障，阻礙抗菌藥物進(jìn)人菌體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用.然而大腸桿菌外膜上存在的多種外膜蛋白質(zhì)，對大多數(shù)疏水性藥物具有良好的通透性。親水的氟喹諾酮類藥物均主要通過大腸桿菌外膜孑L蛋白（OmpF和OmpC，主要是OmpF）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用.然而，膜通透性的改變只能引起大腸桿菌低程度的耐藥。

2.4耐藥基因的傳遞 目前大家最為關(guān)注的問題是耐藥的菌株是否可能將耐藥基因傳遞給人類并導(dǎo)致感染性疾病，國外有一些實驗?zāi)軌蚪o出較為肯定的答案。A.E.van den Bogaard等收集了作為常規(guī)加抗生素喂養(yǎng)的火雞、肉雞和不作為常規(guī)加抗生素喂養(yǎng)的蛋雞糞便中的E.coli，收集了喂養(yǎng)這些家禽的飼養(yǎng)者以及屠宰火雞、肉雞的工人糞便中的E.coli，并將上述獲得的E.coli做環(huán)丙沙星耐藥實驗及PFGE分型。耐藥結(jié)果顯示：源于火雞、肉雞及其飼養(yǎng)者和屠宰者耐藥率高于來源蛋雞及其飼養(yǎng)者耐藥率，并有顯著差異；PFGE分型：來源于兩個農(nóng)場之間的E.coli PFGE分型存在差異，但來源于同一農(nóng)場的火雞、火雞飼養(yǎng)者和屠宰者Ecoli的PFGE分型一致，這些結(jié)果強烈的暗示耐藥菌株的耐藥基因可能從家禽傳遞給人類；但同樣在荷蘭，一個肉牛農(nóng)場常規(guī)使用喹諾酮藥物近20年，卻沒有發(fā)現(xiàn)廣泛的耐藥質(zhì)粒流行，這種現(xiàn)象是否和動物種屬有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

在西班牙的巴塞羅那，有研究者集了117株E.coli，其中，35株源于人血培養(yǎng)，33株源于人糞便，49株源于雞糞便，通過環(huán)丙沙星耐藥實驗，毒力基因測定（papA、sfa/foc、iha、cnf1、fyuA、iutA、iss等21個毒力基因），RAPD和PFGE分型。結(jié)果：人源性耐藥Ecoli與敏感Ecoli的毒力基因具有較大差異但與雞源性耐藥Ecoli的毒力基因較為接近。

氟喹諾酮抗性質(zhì)粒在耐藥性傳遞方面一直被認(rèn)為只是一個誘因。Martínez-Martínez L等應(yīng)用細(xì)菌結(jié)合試驗研究了氟喹諾酮抗性質(zhì)粒的存在與否對E coli耐環(huán)丙沙星和奈啶酸突變頻率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自肺炎克雷伯氏菌的一個多重耐藥質(zhì)粒pMG252轉(zhuǎn)入外膜孔道蛋白不完整的肺炎克雷伯氏菌可使其對環(huán)丙沙星的MIC達(dá)到32 mg/ml。這一質(zhì)粒在其它腸球菌和假單胞菌有廣泛的宿主菌并能表達(dá)氟喹諾酮抗性。含有該質(zhì)粒的E.coli其耐藥性突變的頻率比不含質(zhì)粒的菌株的高100倍，且對環(huán)丙沙星的MIC值增高到原菌株的16倍。

3 防治對策

3.1 合理用藥 減緩細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的關(guān)鍵在于合理用藥。在一些發(fā)達(dá)國家大腸桿菌對氟喹諾酮類耐藥率為10%左右，而在我國達(dá)5O%以上，并且出現(xiàn)了較強的交叉耐藥性，主要是由于濫用、誤用引起。所以在用藥前需要做藥敏試驗，選擇應(yīng)用高敏藥物，同時注意經(jīng)常更換或交叉使用其他藥物以提高療效。除了參考藥敏試驗外，還應(yīng)根據(jù)藥物在體內(nèi)的分布特點選擇藥物和劑量。

3.2 嚴(yán)格控制人獸共用抗菌藥的運用 目前，我國獸用與人用抗菌藥物之間沒有嚴(yán)格區(qū)分，有的則把剛上市的人用新藥轉(zhuǎn)到獸醫(yī)臨床應(yīng)用，這是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性傳遞的一個重要途徑。所以，各級藥政部門要嚴(yán)格把關(guān)，對人用抗菌藥轉(zhuǎn)為獸用應(yīng)該慎重對待。

3.3 聯(lián)合用藥 通過聯(lián)合用藥可擴大抗菌譜、增強療效、減少用量、降低或避免毒副作用，減少或者延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。有報道氟喹諾酮類與頭孢菌素合用時對它們各自的耐藥株具有協(xié)同作用。還有人證實，將多重耐藥泵抑制劑利血平與氟喹諾酮類藥物聯(lián)合運用能顯著抑制細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物耐藥性的發(fā)生，堿化局部環(huán)境也可顯著提高氟喹諾酮類的抗菌活性[9]。

3.4 重視生態(tài)環(huán)境 抗菌素能夠在來源于醫(yī)院、制藥廠和喂抗生素飼料的養(yǎng)殖場的下水道和污水中找到，細(xì)菌耐藥可能從一個生態(tài)系統(tǒng)傳到另一個生態(tài)系統(tǒng)。面對細(xì)菌耐藥，要求我們不僅在醫(yī)院嚴(yán)格執(zhí)行消毒制度，規(guī)范使用抗生素；也要求整個社會與抗生素相關(guān)的各行各業(yè)肩負(fù)起對抗細(xì)菌耐藥的責(zé)任。

3.5 研制新藥 研制新藥是解決氟喹諾酮類藥物耐藥問題的重要途徑之一。氟喹諾酮類藥物不是天然藥物，因此對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造將是非常有效的方案，現(xiàn)已開發(fā)出第四代氟喹諾酮類藥物，但是我們?nèi)匀灰?，?xì)菌的耐藥速度越來越快，解決耐藥的根本途徑在預(yù)防。

4 展望

細(xì)菌耐藥性的日益嚴(yán)重，迫使人們采取各種對策以保護(hù)人類自身的生存安全。喹諾酮類藥物不失為一類療效確切、抗菌廣譜的藥物，該類藥物盡管已經(jīng)出現(xiàn)了不容忽視的耐藥性問題，但仍為許多疾病的治療首選藥?？股剡x擇壓力與細(xì)菌耐藥性的發(fā)展呈正相關(guān)，合理而有效地使用，杜絕亂用、濫用，除了在臨床抗感染治療中應(yīng)合理使用氟喹諾酮類藥物；還要在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)中規(guī)范使用氟喹諾酮類藥物，這不僅保護(hù)了人類自身，也保護(hù)了一類抗菌藥。只有這樣，才能延緩甚至阻斷耐氟喹諾酮類藥物細(xì)菌的傳播和蔓延。

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