DKK1與腫瘤發(fā)展

Wnt信號通路通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生長、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成等過程在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，已成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)[1]。作為Wnt信號通路中重要的分泌型抑制因子，DKK1在腫瘤中的作用亦得到了逐步重視。最新研究表明，分泌性蛋白DKK1（dickkopf-1）在多種腫瘤存在明顯表達(dá)異常，并且其表達(dá)與腫瘤的病理分期及預(yù)后存在明顯的相關(guān)性，提示DKK1有可能成為一個新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，在腫瘤的診斷、治療和復(fù)發(fā)監(jiān)測中發(fā)揮重要作用[2-4]。在此本文就DKK1的結(jié)構(gòu)、在腫瘤發(fā)生發(fā)展、診斷及治療中的作用及其研究前景進(jìn)行綜述。

1 DKK1基因的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

DKK1為Dickkopf基因家族成員。1998年Andrei Glinka等在研究Xenopus胚胎頭部發(fā)育誘導(dǎo)機(jī)制的過程中首次發(fā)現(xiàn)、克隆并定義了DKK1及其家族，并發(fā)現(xiàn)DKK1是誘導(dǎo)胚胎頭部發(fā)育的關(guān)鍵因子[5]。為了進(jìn)一步研究其在人類胚胎發(fā)育中的作用，1999年Fedi P等[6]克隆了人類的DKK1基因。人類DKK1基因位于10q11.2，約3.5kb，編碼一個長約266個氨基酸、分子量大小為28.7KDa的分泌型糖蛋白[7]。在胚胎時期，DKK1在腎臟中表達(dá)最強(qiáng)，其次為肝臟和腦部；在出生后，主要表達(dá)于胎盤和前列腺中[8]。DKK1蛋白的亞細(xì)胞定位主要位于胞漿，結(jié)構(gòu)上包含一個N端的信號序列、兩個保守的富半胱氨酸區(qū)域（Dkk_N和輔脂肪酶折疊區(qū)域）和一個靠近蛋白質(zhì)C端的N-糖基化位點(diǎn)。其中信號序列由20～30個氨基酸組成，負(fù)責(zé)DKK1肽鏈穿越粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和介導(dǎo)DKK1分泌至細(xì)胞外[8]；輔脂肪酶折疊區(qū)域是由一個多個短的β折疊和二硫鍵構(gòu)成的類指結(jié)構(gòu)，可與Wnt受體LRP5/6及另一類穿膜蛋白Kremen1/2結(jié)合形成三聚體、誘導(dǎo)其內(nèi)吞而抑制Wnt信號通路，是DKK1蛋白發(fā)揮功能的平臺[9-11]； Dkk_N區(qū)域為一個包含有一個保守半胱氨酸序列的富半胱氨酸區(qū)域，其在Dickkopf蛋白中位置的變化不但是Dickkopf家族不同成員間相互區(qū)別的標(biāo)志，也是調(diào)節(jié)Dickkopf家族蛋白對Wnt信號通路正向或負(fù)向調(diào)控的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[12]。DKK1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，除Wnt信號途徑本身能通過β-catenin誘導(dǎo)DKK1表達(dá)對其自身進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)外[13]，野生型p53[14]、糖皮質(zhì)激素[15]、孕激素[16]、DNA損傷[17]等均可誘導(dǎo)DKK1的表達(dá)，其精確的調(diào)節(jié)機(jī)制仍待進(jìn)一步探討。

2 DKK1的生物學(xué)功能

Wnt信號通路是細(xì)胞信號通路中最經(jīng)典、最重要的信號通路之一，廣泛參與了細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞遷移及血管發(fā)生等過程，不僅在胚胎發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)揮著中樞作用，而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也具有密切關(guān)系[18]。DKK1作為Wnt信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，亦廣泛參與了上述過程并對其產(chǎn)生著重要影響。

2.1 DKK1與細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱生理性細(xì)胞死亡（physiological cell death，PCD） 是指機(jī)體為更好地適應(yīng)生存環(huán)境，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。正常的細(xì)胞凋亡在胚胎時期能清除多余的和已完成使命的細(xì)胞，維護(hù)胚胎的正常發(fā)育；在出生后能清除衰老和病變的細(xì)胞，保護(hù)機(jī)體的健康，是促進(jìn)生物體進(jìn)化、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和胚胎正常發(fā)育的重要機(jī)制。P53、c-myc、Bcl-2家族、Caspase家族等是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要基因[19]。上述基因表達(dá)失調(diào)或功能缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制而有利于腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和增殖，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。最近研究表明，DKK1在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。2000年美國佐治亞州立大學(xué)Jian Wang等[14]通過cDNA消減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在P53過表達(dá)的人肺腺癌細(xì)胞系H1299中存在DKK1表達(dá)明顯上調(diào)。對DKK1的轉(zhuǎn)錄啟動子序列的進(jìn)一步研究表明，在DKK1轉(zhuǎn)錄起始部位上游2.1 kb處存在P53蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，并且只有野生型的P53而不是突變型P53能激活DKK1的轉(zhuǎn)錄，說明P53可能通過誘導(dǎo)DKK1的表達(dá)而抑制Wnt信號通路、發(fā)揮其抑癌基因作用。2002年Jiang Shou等[17]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG中轉(zhuǎn)染DKK1表達(dá)質(zhì)粒后可明顯促進(jìn)烷化劑BCNU、卡鉑、喜樹堿等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的凋亡與DKK1表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。并且DKK1的過表達(dá)可降低胞內(nèi)β-catenin和出現(xiàn)細(xì)胞端粒的縮短和活性降低，說明DKK1可通過對Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路和端?；钚缘恼{(diào)節(jié)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。除了通過Wnt/β-catenin之外，DKK1還能通過Wnt/JNK等信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2004年Amie Y. Lee等[20]建立了β-catenin表達(dá)缺失的間皮瘤細(xì)胞H28 DKK1過表達(dá)模型。發(fā)現(xiàn)即使在β-catenin表達(dá)缺失的情況下，DKK1的過表達(dá)仍然能有效地促進(jìn)H28細(xì)胞的凋亡，并且其凋亡水平與DKK1過表達(dá)的肺癌細(xì)胞系H450（有β-catenin表達(dá)）相似，且均存在Wnt信號通路轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因DVL-3和suvivin的表達(dá)下調(diào)。但間皮瘤細(xì)胞H28的凋亡在加入JNK特異的阻斷劑SP600125后明顯下降。說明DKK1能通過Wnt/β-catenin、Wnt/JNK等多條信號通路的途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡。DKK1促凋亡功能的缺失可能是部分腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。

2.2 DKK1與細(xì)胞增殖 細(xì)胞過度增殖是腫瘤的主要特征，其機(jī)制主要來源于3個方面：細(xì)胞周期失控、生長接觸性抑制的喪失和定著依賴性（anchorage dependence）的喪失?；謴?fù)腫瘤細(xì)胞的正常細(xì)胞周期、接觸性抑制和定著依賴性可以達(dá)到抑制腫瘤生長、增殖，是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。在腫瘤細(xì)胞中，過度激活的Wnt信號可通過上調(diào)C-MYC、Cyclin D1和下調(diào)細(xì)胞粘附因子而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞周期失控、生長接觸性抑制和定著依賴性的喪失的目的。

作為Wnt信號的調(diào)控因子，DKK1在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖過程中扮演這雙重角色。在部分細(xì)胞中，DKK1是刺激細(xì)胞從生長停滯期進(jìn)入對數(shù)生長期的關(guān)鍵蛋白。早在1997年Bruder等學(xué)者就發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的過程中，hMSCs在進(jìn)入對數(shù)生長期前都要經(jīng)歷3～5 d的生長停滯期，而將處于對數(shù)生長期的hMSCs的培養(yǎng)基加入剛替換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基的hMSCs中可促進(jìn)其分裂增殖，這說明在對數(shù)生長期的hMSCs的培養(yǎng)基中存在某種刺激因子能促進(jìn)hMSCs分裂增殖。為進(jìn)一步明確其機(jī)制，2003年Carl A. Gregory 等采用包含[35S]-甲硫氨酸的培養(yǎng)對hMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，以標(biāo)記和監(jiān)測在細(xì)胞培養(yǎng)基中新出現(xiàn)的分泌性蛋白。結(jié)果顯示，DKK1在hMSCs由生長停滯期進(jìn)入對數(shù)生長期的過程中明顯升高，并在hMSCs生長進(jìn)入穩(wěn)定期后逐漸降低。說明DKK1可能在誘導(dǎo)hMSCs分裂增殖的過程中發(fā)揮了重要作用。為了進(jìn)一步驗證這一設(shè)想，Carl A. Gregory等在處于生長停滯期的hMSCs培養(yǎng)基中加入了人工合成的DKK1蛋白。結(jié)果顯示該培養(yǎng)基中hMSCs的增殖明顯早于培養(yǎng)基中未加入DKK1蛋白的hMSCs，并且增殖速度明顯增快。對hMSCs增殖前后的cDNA芯片及免疫熒光檢測顯示，當(dāng)hMSCs培養(yǎng)基加入DKK1蛋白后，其核內(nèi)及細(xì)胞骨架上的β-catenin的表達(dá)明顯減少，并出現(xiàn)JNK信號通路活性明顯減低及血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）表達(dá)下降。而在hMSCs培養(yǎng)基中加入DKK1抗體能明顯抑制hMSCs細(xì)胞的分裂增殖。說明對于hMSCs DKK1可通過抑制Wnt/β-catenin和Wnt/ JNK信號通路并通過降低細(xì)胞粘附抑制接觸性抑制而促進(jìn)hMSCs的分裂增殖。為了進(jìn)一步驗證其對腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控，Carl A. Gregory 等將DKK1抗體加入存在DKK1蛋白表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞系（MG-63）的培養(yǎng)基中，MG-63細(xì)胞系的生長停止，說明DKK1是影響該類腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素。與上述現(xiàn)象不同的是，在后來的研究中也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，DKK1能抑制多種DKK1表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞的生長尤其是錨定非依賴性的生長，如宮頸癌細(xì)胞系Hela、黑色素瘤細(xì)胞MDA-MB435、間皮瘤細(xì)胞系H28[20]、絨毛膜癌細(xì)胞系JEG3等。并且這些細(xì)胞在過表達(dá)DKK1后，裸鼠成瘤能力明顯下降。從上述研究中可以看出，DKK1對細(xì)胞生長的調(diào)控在不同的細(xì)胞中作用是不同的，這種差異可能是由于各類細(xì)胞中DKK1及其他基因的表達(dá)譜差異而造成。

2.3 DKK1與細(xì)胞遷移 細(xì)胞遷移是細(xì)胞發(fā)揮其生理功能關(guān)鍵過程。在胚胎發(fā)育過程，對胚胎細(xì)胞遷移的適時誘導(dǎo)是胚胎體軸發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、肢體發(fā)育等過程的關(guān)鍵機(jī)制；而出生后體細(xì)胞的適時遷移有利于機(jī)體的生長、免疫和自我修復(fù)功能。Wnt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵信號通路之一，它能通過誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）關(guān)鍵基因MMP7、MT-MMP的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動、降低細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附，并能通過促進(jìn)血管生成相關(guān)因子C0X-2、VEGF的表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，為腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移路徑。DKK1通過對Wnt信號途徑的負(fù)調(diào)控，對細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了重要影響。2006年Jurgen Pollheimer等研究了DKK1對滋養(yǎng)層母細(xì)胞SGHPL-5的遷移能力的影響。結(jié)果顯示，在SGHPL-5培養(yǎng)基中加入DKK1后，SGHPL-5 在Transwell實驗中的運(yùn)動能力明顯下降，遷移細(xì)胞數(shù)由（240%±35%）降至（58%±31%），并且SGHPL-5細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1表達(dá)水平降至39%，β-catenin表達(dá)水平降至41%。說明DKK1能夠通過負(fù)調(diào)控Wnt信號通路降低細(xì)胞的遷移能力。但有趣的是， Takumi Yamabuki等[3]發(fā)現(xiàn)在將DKK1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入成纖維細(xì)胞系NIH3T3和COS-7后，卻能明顯促進(jìn)上述細(xì)胞在Transwell實驗中的侵襲能力。進(jìn)一步證明了，細(xì)胞信號通路是一個復(fù)雜的網(wǎng)路系統(tǒng)，DKK1作為Wnt信號通路的細(xì)胞外上游作用因子，其功能很可能由于不同細(xì)胞間基因的表達(dá)差異和突變導(dǎo)致功能存在巨大差異。

2.4 DKK1在人類腫瘤中的表達(dá)及其與腫瘤臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 與DKK1生物學(xué)功能在不同細(xì)胞間存在差異相似的是，在不同腫瘤類型中DKK1表達(dá)水平及功能亦存在巨大變化。

目前研究顯示，在惡性黑色素瘤和結(jié)腸癌組織[2]中DKK1表達(dá)水平明顯下降。由于Wnt信號途徑在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著核心角色，作為Wnt信號途徑的重要抑制因子，DKK1在結(jié)腸癌的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制及作用得到了較深入的探討。2005年Gonza lez-Sancho1 JM等[2]在研究結(jié)腸癌組織中DKK1表達(dá)規(guī)律的過程中發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號途徑的激活雖然能促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞系hela細(xì)胞和人胚胎腎293細(xì)胞中DKK1的表達(dá)，但在32例結(jié)腸癌患者組織中卻并未發(fā)現(xiàn)DKK1的表達(dá)上調(diào)，甚至在部分病例還出現(xiàn)明顯的下調(diào)（15/32）。為了進(jìn)一解釋這一現(xiàn)象，2006年O Aguilera等[2]對9種結(jié)腸癌細(xì)胞系DKK1基因啟動子區(qū)域的甲基化水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)存在DKK1低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系均存在啟動子區(qū)域CpG島的高度甲基化，并且發(fā)現(xiàn)DKK1啟動子區(qū)域CpG島的高度甲基化僅存在DUCK's C期和D期來源的細(xì)胞系。在54例結(jié)腸癌標(biāo)本中，9例DKK1啟動子區(qū)域CpG島甲基化的腫瘤亦僅見于DUCK's C期和D期的患者，而Duke's B患者DKK1啟動子區(qū)域無甲基化。并且在結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1中過度表達(dá)DKK1能抑制明顯該細(xì)胞的增殖和皮下成瘤能力。這些都說明DKK1的表達(dá)下調(diào)可能是促使結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，啟動子甲基化可能是導(dǎo)致DKK1在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制。但同時我們也應(yīng)該注意到，在54例結(jié)腸癌標(biāo)本中有45例并未存在啟動子的甲基化，這說明在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中DKK1的表達(dá)還存在除甲基化外的其他調(diào)節(jié)機(jī)制。

與上述腫瘤相反的是DKK1在乳腺癌[3]、肺癌、食管鱗癌[4]、肝細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞瘤和Wilms瘤中表達(dá)水平明顯增高。M-A Forget等[3]發(fā)現(xiàn)DKK1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)正常乳腺組織（21/73），且主要表達(dá)于ER-/PR-、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有乳腺癌家族史的患者乳腺癌組織中。而在各類乳腺癌中，ER-/PR-乳腺癌組織中DKK1的表達(dá)明顯高于ER+/PR-和ER-/PR+的乳腺癌組織；在具有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移尤其是有10個以上腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其表達(dá)水平更高。并且腫瘤TNM分期越晚，乳腺癌組織中DKK1的表達(dá)水平越高，ⅢC期患者乳腺癌組織的DKK1表達(dá)陽性率為100%。預(yù)后分析顯示，DKK1陽性表達(dá)的乳腺癌患者相對于DKK1表達(dá)陰性的患者預(yù)后更差。這些都說明，在乳腺癌組織中DKK1的表達(dá)與ER和PR受體相關(guān)的分子分型有關(guān)，其表達(dá)上調(diào)可能預(yù)示著乳腺癌的不良預(yù)后，并且DKK1可能參與了乳腺癌的遺傳發(fā)生機(jī)制。與上述發(fā)現(xiàn)相同的是， Takumi Yamabuki等[4]在肺癌和食管鱗癌的cDNA芯片結(jié)果中亦發(fā)現(xiàn)DKK1在腫瘤組織的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的正常組織。且在肺癌組織中DKK1表達(dá)水平越高，患者生存期越短。尤其有意義的是，多因素回歸分析結(jié)果顯示DKK1是除年齡、分化程度和TNM分期外，影響肺癌患者預(yù)后的一個獨(dú)立危險因素。在280例食管癌患者癌組織標(biāo)本的免疫組化檢測中，DKK1高表達(dá)組食管鱗癌患者中位生存時間明顯低于低表達(dá)組患者。這些說明DKK1可能在肺癌和食管鱗癌的發(fā)展過程中發(fā)揮促癌基因的作用。

DKK1在多種腫瘤中的顯著表達(dá)差異及其分泌蛋白的特性使其有可能成為一個新的血清診斷學(xué)指標(biāo)用于腫瘤的診斷、復(fù)發(fā)檢測和預(yù)后分析。目前人們已發(fā)現(xiàn)其在惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤患者血清中表達(dá)明顯上調(diào)，并且其表達(dá)與腫瘤的分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后存在明顯相關(guān)性。尤其是在甲胎蛋白表達(dá)陰性的肝癌患者中，其診斷敏感性為70.4%、特異性為90%，并可從甲胎蛋白陽性的慢性乙型肝炎及肝硬化等高?；颊咧需b別診斷肝細(xì)胞癌，鑒別診斷敏感性達(dá)69.1%、特異性為84.7%。DKK1蛋白與甲胎蛋白聯(lián)合應(yīng)用，可將肝細(xì)胞癌總體診斷率提高至88%。DKK1這一特性對于提高早期肝癌診斷率，檢測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有重要意義，成為肝癌血清學(xué)診斷中一個新的重要指標(biāo)。

3結(jié)論

綜上所述，DKK1作為Wnt信號途徑的抑制因子，廣泛參與了細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞運(yùn)動的調(diào)節(jié)，其在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)變化對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了重要影響，并且與腫瘤的臨床病理特征及預(yù)后有著重要的聯(lián)系。這說明DKK1的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的存在廣泛的關(guān)聯(lián)，其在腫瘤中表達(dá)特異性高，易于檢測的特點(diǎn)使其有可能成為良好的腫瘤診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步深入研究其調(diào)控機(jī)制及腫瘤診治過程中價值，對于完善腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，指導(dǎo)腫瘤治療，改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后將具有重要意義。

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編輯/張燕