紫杉醇提取及分離純化技術(shù)研究進(jìn)展

常杰華　張萬忠

摘要 紫杉醇是從紅豆杉屬植物分離出來的一種具有獨(dú)特抗癌機(jī)制的二萜類化合物，紫杉醇因其獨(dú)特的抗癌機(jī)理及其顯著療效而倍受重視。目前紫杉醇主要來自于紅豆杉屬植物中，提取和分離純化技術(shù)是從紅豆杉屬植物中獲得紫杉醇必須的技術(shù)手段。在此較為全面地論述了近年來國內(nèi)外紫杉醇的提取純化技術(shù)。

關(guān)鍵詞 紫杉醇；提?。环蛛x純化；技術(shù)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）11-03388-03

Abstract Paclitaxel is a kind of two terpenoids with unique antitumor mechanism isolated from Taxus plants， attracted the attention because of its unique anticancer mechanism and remarkable curative effect. Taxol are mainly from Taxus plants， extraction and separation， purification technology is the necessity mean for obtaining taxol from Taxol plants. The extraction and purification technologies for Paclitaxel at home and abroad in recent years were elaborated.

Key words Taxol； Extraction； Separation and purification； Technology； Research progress

紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是一種二萜類化合物，具有獨(dú)特的抗癌機(jī)理，是近30年來發(fā)現(xiàn)的重要抗癌藥之一[1-2]。目前，紅豆杉屬植物仍是獲得紫杉醇的主要來源，從紅豆杉中直接提取分離或以分離提取的紫杉醇結(jié)構(gòu)類似物為原料合成紫杉醇是獲得紫杉醇的主要途徑。迄今，紫杉醇主要還是從天然和人工栽培紅豆杉的枝葉或樹皮中直接提取。紫杉醇的不穩(wěn)定，分離周期長，易受酸堿、溫度等條件的影響發(fā)生異構(gòu)和降解，同時(shí)，分離效率低導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，又使有限的紅豆杉的資源難以達(dá)到有效的利用。因此，對紫杉醇的提取和純化技術(shù)進(jìn)行更深入全面的探究，建立快速、高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的提取和分離純化方法顯得十分必要和緊迫。筆者在此綜述了紫杉醇的提取和分離純化技術(shù)。

1 紫杉醇的提取方法

1.1 溶劑萃取法

溶劑萃取常用于紫杉醇粗提階段，粗提階段一般包括初級(jí)萃取和次級(jí)萃取。對于從植物體和細(xì)胞培養(yǎng)物中初步提取紫杉醇，主要采用溶劑萃取法。Mcpartland等通過液液萃取法對細(xì)胞培養(yǎng)物中的紫杉醇進(jìn)行了分離純化，以及對不同的溶劑和紫杉醇的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較全面的研究[3]。初級(jí)萃取和次級(jí)萃取一般采用不同的溶劑系統(tǒng)。有研究表明，在甲醇、乙醇、己烷、異丙醇、乙醚、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-二氯甲烷、乙酸乙酯-丙酮、乙酸乙酯-乙醚等溶劑中，單一溶劑以甲醇提取效果最好，混合溶劑則以乙酸乙酯-丙酮（1∶1）提取的效果最好[4]。近年來，隨著超聲技術(shù)的引入，大大縮短了初級(jí)萃取過程的時(shí)間，萃取達(dá)到平衡的時(shí)間約為20～40 min[5]，而無超聲振蕩所需時(shí)間長達(dá)16～48 h[6]。在進(jìn)行紅豆杉屬細(xì)胞培養(yǎng)紫杉醇的分離中，Lee等引入了另一種新技術(shù)——微波輔助萃取技術(shù)，大大縮短了時(shí)間，且收率高達(dá)95%[7]。

另外，超聲和微波等技術(shù)可使試驗(yàn)在較低溫下進(jìn)行，避免紫杉醇在高溫下降解或異構(gòu)而降低了其回收率。

1.2 固相萃取法

由于紅豆杉屬植物體材料中成分復(fù)雜，紫杉醇含量極低，且有與紫杉醇結(jié)構(gòu)極為相似的紫杉烷類物質(zhì)，提取分離困難，而固相萃取法（SPE）可快速除去紫杉醇浸膏中的脂、蠟及色素等雜質(zhì)，大大減輕了后續(xù)色譜分離負(fù)擔(dān)。Li等利用中性氧化鋁萃取，并結(jié)合大孔吸附樹脂為固定相的第二色譜法進(jìn)行紫杉醇的分離純化，回收率達(dá)98.3%[8]。在萃取真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物過程中，龐欣等用苯基固相柱進(jìn)行固相萃取，效果顯著[9]。

固相萃取法是一種省時(shí)、省溶劑、萃取效率高以及選擇性好的新型萃取方法，可簡化操作過程，降低成本，因而倍受青睞。

1.3 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃?。⊿FE）是近代化工分離中出現(xiàn)的高新技術(shù)。在紫杉醉的純化過程中，該技術(shù)減少了含氯有機(jī)溶劑的使用，是一種比較環(huán)保的的新技術(shù)。超臨界萃取最常用的溶劑是CO2，其具有類似氣體的擴(kuò)散系數(shù)、液體的溶解力，表面張力為零，能迅速滲透進(jìn)固體物質(zhì)之中，具有高效、不易氧化、純天然、無化學(xué)污染等特點(diǎn)。

Qiao等利用CO2及乙醇的混合物為超臨界流體萃取紅豆杉枝葉，紫杉醇的回收率達(dá)89.57%，選擇性也大大提高[5]。但該法對儀器設(shè)備要求較高，限制了其應(yīng)用。

1.4 膜分離法

膜分離法是一種新型隔膜分離技術(shù)。Carver等研究了反滲透膜和超濾膜在紫杉烷類物質(zhì)的分離過程中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)膜分離技術(shù)可使浸膏中紫杉烷類物質(zhì)的濃度提高5倍左右，大大減少了后續(xù)色譜分離的負(fù)擔(dān)[10]。張梅等利用0.5 μm微孔濾膜對提取浸膏進(jìn)行過濾，紫杉醇雜質(zhì)去除率達(dá)31.5%，回收率89.7%以上[11]。膜分離法可省去液液萃取步驟，節(jié)省了萃取溶劑。

1.5 樹脂層析法

大孔樹脂吸附分離技術(shù)是一種提取精制的新工藝，廣泛用于純化苷類、黃酮類、生物堿類成分。對紫杉醇結(jié)構(gòu)的研究表明，其分子上的多環(huán)結(jié)構(gòu)易被帶苯環(huán)的吸附劑吸附，這為大分子樹脂應(yīng)用于分離純化紫杉醇提供了可能。Chen等研究發(fā)現(xiàn)D101和WLD3混合樹脂對紫杉醇有很好的分離效果，回收率達(dá)93%[12]。

李勇超等采用D4020型大孔樹脂對紅豆杉產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌發(fā)酵液的粗提液進(jìn)行吸附和洗脫試驗(yàn)，結(jié)果表明D4020型吸附樹脂對紫杉醇吸附分離效果顯著，回收率達(dá)90%[13]。

樹脂層析法分離純化紫杉醇具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，若能根據(jù)紫杉醇的物化性質(zhì)研制出比較專一的分離紫杉醇的新型樹脂，那么樹脂層析法將會(huì)得到更為廣泛的應(yīng)用。

1.6 柱切換技術(shù)法

柱切換技術(shù)是近10年里應(yīng)用越來越廣泛的一種色譜分析技術(shù)，主要用于復(fù)雜樣品的分析，有效簡化樣品處理過程，縮短了分析時(shí)間，達(dá)到樣品在線凈化和組分富集的目的。液相色譜柱切換法是一種在線的固相分離技術(shù)，常用一個(gè)長3～5 cm、填料粒徑 25～40 μm的預(yù)處理柱，選擇一個(gè)低溶劑強(qiáng)度的流動(dòng)相使樣品凈化、富集；啟動(dòng)切換閥，組分進(jìn)入分析柱分離測定。該法可以獲得高純度的樣品，在紫杉醇的提取分離中有廣泛應(yīng)用。

2 紫杉醇的分離純化

2.1 柱色譜法

柱色譜法是目前分離純化紫杉醇最普遍采用的方法，分為正相色譜和反相色譜，根據(jù)吸附劑的不同，常見的正相柱有硅膠、氧化鋁等，反相柱有C18、苯基柱等，還包括其他一些特制的吸附劑。

雒麗娜等在反相色譜中使用了一種新型的自制多孔高分子樹脂填料（PRP6）作為固定相，結(jié)果表明，PRP6對紫杉醇和三尖杉寧堿（cephalomannine）具有高的選擇性，不可逆吸附小，且填料可回收再利用[14]。Pyo等HPLC采用二氧化硅和十八烷基硅膠（ODS）為固定相，以1.5%～1.8%甲醇的二氯甲烷洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇的回收率達(dá)90%以上，純度達(dá)99.5%以上[15]。李長明等將2根層析柱用管道串聯(lián)且2根層析柱之間設(shè)置用于控制分流的三通閥的，在2根層析柱中裝入不同的固定相，從而實(shí)現(xiàn)在一個(gè)層析系統(tǒng)中使用2種固定相，增加了固定相和目標(biāo)產(chǎn)物之間的選擇性，并通過將三元流動(dòng)相和二元固定相在一個(gè)層析系統(tǒng)中進(jìn)行巧妙組合，提高了分離效率，降低了生產(chǎn)成本[16]。Li等采用中壓硅膠柱分離紫杉醇，以二氯甲烷∶乙腈（7∶3）的體積比為流動(dòng)相對紫杉醇進(jìn)行了純化，經(jīng)過一次柱層析紫杉醇的回收率就達(dá)75%以上，結(jié)晶后純度達(dá)99%[17]。

2.2 其他色譜法

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，除了高效液相色譜（HPLC）外，陸續(xù)有新的色譜技術(shù)在紫杉醇的分離純化中被引用，常見的有薄層色譜（TLC）、高效置換色譜法（HPDC）、高效逆流色譜（HSCCC）、膠束電動(dòng)色譜（MEKC）等。

Gangadevi等為了測定由藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的紫杉醇，建立了紫杉醇檢測的薄層層析（TLC）方法，結(jié)果表明，應(yīng)用薄層層析技術(shù)對真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測比HPLC方法更加高效，能夠簡便、準(zhǔn)確地篩選到紫杉醇產(chǎn)生菌株，且可以初步推測菌株的紫杉醇產(chǎn)生能力[18]。

HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達(dá)到分離的目的。Watchueng等首先運(yùn)用甲醇-水-三氟乙酸（10.0∶89.9∶0.1，V/V/V）萃取，所提取的紫杉醇被吸附在C18AQ（50 mm×20 mm，20 μm）捕集柱上，然后將4.6 mm內(nèi)徑的C18柱連接到這種C18柱上，使用等濃度的乙腈-水-三氟乙酸（30.0∶69.9∶0.1，V/V/V）的流動(dòng)相組成的十六烷基吡啶鎓三氟乙酸鹽（3 mg/ml）的置換劑對紫杉醇進(jìn)行洗脫，且自然結(jié)晶，最終結(jié)晶到114 mg的紫杉醇，回收率達(dá)90%，純度達(dá)99.4%[19]。

HSCCC技術(shù)是20世紀(jì)80年代美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)明的一種基于動(dòng)態(tài)液-液分配機(jī)理新型色譜分離純化技術(shù)。HSCCC技術(shù)具有制備量大、回收率高、消耗溶劑少的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)在操作上所表現(xiàn)出的靈活性和多功能性是其他色譜所不能比擬的。盡管HSCCC技術(shù)有許多理論和技術(shù)問題需要進(jìn)一步研究解決，但因其具有其他色譜所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)勢，并隨著相關(guān)的理論和技術(shù)的不斷完善，HSCCC技術(shù)勢必會(huì)在天然藥物分離、分析領(lǐng)域以及生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)揮越來越大的作用。

Chan等利用膠束電動(dòng)色譜（MEKC）體系來分離紫杉醇以及紫杉烷類化合物（三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ以及它們的去乙酰衍生物），采用 Beckman P/ACE毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，使納克級(jí)的樣品用幾微升的溶劑在 15 s內(nèi)完成了分離，大大地減少溶劑的浪費(fèi)[20]。

2.3 化學(xué)反應(yīng)法

化學(xué)反應(yīng)法是通過化學(xué)的方法將2種或2種以上的物質(zhì)分開，在紫杉醇中的應(yīng)用就是通過化學(xué)的方法將紫杉醇與紫杉醇結(jié)構(gòu)相似的三尖杉寧堿（cephalomannine）分離，通過化學(xué)反應(yīng)將三尖杉寧堿轉(zhuǎn)化為易與紫杉醇分離的物質(zhì)，然后再經(jīng)過相應(yīng)的分離技術(shù)加以分離。因紫杉醇和三尖杉寧堿（cephalomannine）這2種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中只有C-13側(cè)鏈末端不同，導(dǎo)致了它們的結(jié)構(gòu)非常相似，因此兩者的色譜行為也很相似，用常規(guī)的色譜技術(shù)很難將二者完全分開。

李隆等將紫杉醇和三尖杉寧堿的混合物溶于甲醇中，加入有機(jī)堿類催化劑1，8-二氮雜二環(huán)-雙環(huán)（5，4，0）-7- 十一烯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三尖杉寧堿能與這種催化劑發(fā)生1，4-加成反應(yīng)生成3”- 烷氧基三尖杉寧堿衍生物，而與其結(jié)構(gòu)相似的紫杉醇卻沒有發(fā)生任何反應(yīng)，最終的混合物經(jīng)膠柱層析就可以將紫杉醇和三尖杉寧堿（cephalomannine）分開[21]。鄭玲等對三尖杉寧堿進(jìn)行溴代反應(yīng)，使cephalomannine 轉(zhuǎn)化為2，3dibromocephalomannine，而紫杉醇不受影響，結(jié)果表明溴代反應(yīng)后2，3dibromocephalomannine與紫杉醇的比移值大大分開，有利于紫杉醇的分離純化，經(jīng)硅膠柱分離純化，紫杉醇的純度達(dá)95%以上[22]。

2.4 藥理藥靶法

藥理作用靶點(diǎn)法是根據(jù)藥物藥理作用原理提出的一種藥物分離純化的新型技術(shù)方法，是以藥理作用靶點(diǎn)作為分離介質(zhì)，使抗癌藥物與靶點(diǎn)特異性的、可逆的相互作用而進(jìn)行抗癌藥物的分離純化。有研究表明紫杉醇的作用靶點(diǎn)是體內(nèi)的微管（微管蛋白的聚合態(tài)），微管蛋白具有高溫下聚合低溫下解聚的特點(diǎn)；紫杉醇可與微管特異性的結(jié)合并能抑制微管的解聚，而不與解聚狀態(tài)下的微管二聚體發(fā)生作用，與紫杉醇結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的三尖杉寧堿（cephalomannine）則不具有這種特性，進(jìn)而達(dá)到了紫杉醇和三尖杉寧堿較好的分離[23]。

作為一種新型的分離純化技術(shù)，藥理藥靶法具有簡便、高效特異性的特點(diǎn)；紫杉醇在天然抗癌藥物方面以及紫杉醇藥理作用靶點(diǎn)微管在藥理作用靶點(diǎn)方面均具有代表性，其研究成果易于推廣到其他抗癌物質(zhì)及其藥理作用靶點(diǎn)的物系，具有普遍應(yīng)用價(jià)值。

2.5 細(xì)胞生物學(xué)方法

紫杉醇作為一種抗癌藥物，其抗癌機(jī)理是在一定條件下誘導(dǎo)微管蛋白聚合并抑制其解聚，從而抑制細(xì)胞分裂。根據(jù)這一特性，利用紫杉醇依賴性細(xì)胞系的這種可逆性的、特異性的相互作用，紫杉醇及其紫杉烷類化合物達(dá)到了分離純化的目的。但因該方法缺少專一性，限制其生產(chǎn)中的應(yīng)用。

3 結(jié)論

從紅豆杉屬植物中提取紫杉醇的方法已相當(dāng)成熟，但因其在紅豆杉中的含量很低，隨著紫杉醇在市場上的需求增加，僅依靠從紅豆杉屬植物中提取紫杉醇是根本無法滿足日益增長的市場需求。紅豆杉屬植物不是優(yōu)勢樹種，紅豆杉的大量砍伐不僅會(huì)導(dǎo)致紅豆杉資源的枯竭，還會(huì)造成環(huán)境的破壞，帶來嚴(yán)重的環(huán)保問題。隨著新方法、新技術(shù)在紫杉醇生產(chǎn)工藝中的不斷引入，加上提取分離技術(shù)的不斷更新。這些技術(shù)方法必將促進(jìn)紫杉醇的高效、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，改變目前紫杉醇在市場上供不應(yīng)求局面，并促進(jìn)醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)的發(fā)展及人類健康事業(yè)的較大進(jìn)步。

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