豐水梨多酚氧化酶氧化茶多酚的研究

羅玲等

摘要

[目的]提高茶黃素生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，降低生產(chǎn)成本。[方法]采用單因素試驗探索了茶多酚與豐水梨質(zhì)量比從1∶1～1∶50的反應(yīng)比例條件，10～25 ℃的溫度條件，3.5～6.5的pH條件，以及20～60 min的反應(yīng)時間對多酚氧化酶氧化茶多酚的影響。采用正交試驗，研究了酶與底物質(zhì)量比、溫度、時間、pH 4個因素對豐水梨多酚氧化酶（PPO）氧化茶多酚形成茶黃素的影響。[結(jié)果]單因素試驗結(jié)果顯示，經(jīng)組內(nèi)比較，反應(yīng)比例1∶40、反應(yīng)溫度20 ℃、pH 5.5、反應(yīng)時間40 min下所得產(chǎn)物，用高精度測色儀檢測，a值最大，紅色最深。正交試驗結(jié)果表明，4 個因素對茶多酚的氧化均有顯著影響。其中，對茶多酚氧化的影響程度依次為質(zhì)量比>時間>pH>溫度，最佳組合為茶多酚與酶源質(zhì)量比1∶40，溫度20 ℃，pH 5.5，氧化時間40 min，茶多酚的轉(zhuǎn)化率為45.70%。[結(jié)論]該研究可為尋求低成本的茶黃素生成途徑提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 豐水梨；多酚氧化酶；茶多酚 ；茶黃素

中圖分類號 S661.2；Q946.81+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03395-04

Abstract [Objective] To improve the economic benefit of theaflavins production and reduce production cost. [Method] By using single factor experiment， effects of tea polyphenols and HSBC pear ratio from 1∶1 to 1∶50， temperature from 10 to 25 ℃， pH from 3.5 to 6.5， and the reaction time from 20 min to 60 min on oxizizing polyphenols with polyphenol oxidase were explored. [Result] The results of single factor experiment showed： in the within group comparisons， the products of the reaction ratio of 1∶40， reaction temperature 20 ℃， pH 5.5， reaction time 40 min has the largest a value and the deepest red wich was defined by the high accuracy of color measurement instrument. The design of multifactor orthogonal experiment was applied to investigate the effects of temperature，pH value and time on the tea polyphenols being oxidized into Theaflavins by the PPO of HSBC pear.The 4 factors and 3 levels orthogonal test results showed that： 4 factors all have influence on oxidation of tea polyphenols. Among them， the order of influence degree of the oxidation of tea polyphenols are：quality ratio >time > pH> temperature. The optimal combination ： tea polyphenols to enzyme source 1∶40 in quality ， temperature 20 ℃， pH value 5.5， reaction time 40 min.The rate of conversion of tea polyphenols is 45.70%. [Conclusion] The study can provide reference for seek low cost production way of theaflavins.

Key words HSBC pear； Polyphenol oxidase； Polyphenols； Theaflavins

多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）又稱兒茶酚氧化酶[1]，豐水梨含有較高活性的PPO，天然狀態(tài)下與內(nèi)囊體膜結(jié)合在一起無活性，但將組織勻漿或損傷后酶活被活化，從而表現(xiàn)出活性[2]。茶多酚（tea polyphenols，TP）中的主要成分兒茶素類主要包括表沒食子兒茶素（Epigallocatechin， EGC）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate， ECG）[3]。這4種兒茶素在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化縮合形成對應(yīng)種類的茶黃素TF、TF2a、TF2b、TF3，顏色從淡黃色變成紅色[4]。

茶黃素（theaflavins，TFs）具有多種藥理功能與保健功效，如降血脂、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗突變、抗癌防癌等[5-8]，某些功能方面甚至優(yōu)于兒茶素[9]，所以其在食品、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域的作用也越來越突出[10]。目前對茶黃素的制備主要分為酶促氧化和化學(xué)氧化系統(tǒng)[11-12]。筆者采用L9（43）正交試驗研究酶源與底物比例、溫度、pH、時間對茶多酚氧化程度的影響，篩選出4個因素的最優(yōu)組合，從而提高茶黃素生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：

豐水梨，山東煙臺。

主要試劑：茶多酚，四川富正源生物科技有限公司，批號TPH30523C1；乙酸乙酯、檸檬酸、檸檬酸鈉等，均為分析純。

主要設(shè)備儀器：UV2100型紫外可見分光光度計，上海尤尼克柯儀器有限公司；Datacolor 400 高精度臺式分光光度測色儀；安捷倫1260高效液相色譜儀；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；發(fā)酵罐；MJBL25C3攪拌機(jī)，廣東美的精品電器制造有限公司等。

1.2 方法

1.2.1

單因素試驗。

取TPH30523C1批號的茶多酚10.00 g作為反應(yīng)底物。分別取梨10、50、100、150、200、250、300、350、400 g，用攪拌機(jī)勻漿（1 min）。分別將底物與酶的混合物置于發(fā)酵罐中，25 ℃（實驗室溫度）、pH 4.8[13]（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)制，豐水梨漿液pH）、通空氣量0.6 L/min、攪拌速度300 r/min的條件下反應(yīng)40 min[11]。產(chǎn)物經(jīng)100 ℃沸水迅速滅酶（保證反應(yīng)時間的一致性）。將混合液經(jīng)2層紗布過濾，濾液經(jīng)等體積乙酸乙酯萃取3次，取上層紅色液體，經(jīng)低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后轉(zhuǎn)入真空干燥箱干燥（40 ℃，1 h）得到紅色固體粉末。將紅色固體粉碾壓均勻得到均勻的固體粉末。以上試驗均重復(fù)3次。

選取以上試驗獲得的最佳反應(yīng)比例分別在溫度10、15、20、25 ℃；pH 3.5、4.5、5.5、6.5（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）、通空氣量0.6 L/min、攪拌速度300 r/min的條件下反應(yīng)20、30、40、50、60 min。反應(yīng)后產(chǎn)物的處理與反應(yīng)比例篩選試驗保持一致。 按上述條件反應(yīng)后，所得產(chǎn)物的處理與單因素試驗操作保持一致。

1.3 測定內(nèi)容及方法

1.3.1

單因素試驗。

單因素試驗所得產(chǎn)物以反應(yīng)前茶多酚作為對照，采用高精度測色儀測定產(chǎn)物的色度值，以a（a值表示紅綠，+表示偏紅，-表示偏綠，a值越大，產(chǎn)物紅色越深）值作為判定依據(jù)；采用比色法測定產(chǎn)物的吸光值（A），從而得知總酚的含量。

1.3.2

正交試驗。

以反應(yīng)前茶多酚作為對照，采用高精度測色儀測定產(chǎn)物的色度值，以a值作為判定依據(jù)；采用比色法測定產(chǎn)物的吸光值（A）；采用高效液相色譜法，測定4種兒茶素的濃度變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1

產(chǎn)物色度值。由圖1可見，茶多酚與酶源質(zhì)量比為1∶40時，所得產(chǎn)物a值最大；茶多酚與酶源質(zhì)量比從1∶1到1∶40的反應(yīng)比例條件下制備的產(chǎn)物a值呈現(xiàn)不同程度的遞增趨勢，而從1∶40到1∶50則呈現(xiàn)遞減趨勢。由圖2可見，pH為5.5時產(chǎn)物a值最大，pH較低時對產(chǎn)物a值的影響小于pH較大時。由圖3可見，反應(yīng)時間為40 min時所得產(chǎn)物a值最大，且反應(yīng)時間不足對a值影響大于反應(yīng)時間過度對a值的影響。

利用天然來源的PPO制備茶黃素既經(jīng)濟(jì)又高效，這對尋求低成本的茶黃素生產(chǎn)途徑具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]

鄔顯章.酶的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)[M].長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1988.

[2] TOLBERT N E.Activation of polyphenol oxidase of chloroplasts[J].Plant Physiol，1973，51：575-580.

[3] 宛曉春.茶葉生物化學(xué)[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：9210，30231，225-227，250-251.

[4] 李大祥，宛曉春，楊昌軍，等.茶兒茶素氧化機(jī)理[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（1）：171-181.

[5] 杜棋珍，江和源.茶色素的藥理及應(yīng)用陰[J].中國茶葉，1997，19（5）：36-37.

[6] STEELE V E，KELLOFF G J，BALETITINE D，et al.Comparativechemopreventivemechanism of green tea，black tea and sekected polyphenol[J].Carcinogenesis，2000，21（1）：63-67.

[7] 金恩慧，吳媛媛，屠幼英，等.茶黃素抑菌作用的研究[J].中國食品學(xué)報，2011，11（6）：108-117.

[8] 劉偉，周潔，龔正禮.茶黃素的功能活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2013（11）：394-399.

[9] 謝筆均.綠茶、烏龍茶、紅茶中主要成分和酚類化合物抑制脂肪氧合酶活性和抗油脂自動氧化特性的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1994（4）：20-23.

[10] 潼野慶則，今川.茶葉兒茶酚氧化機(jī)制的研究[J].日本農(nóng)藝學(xué)會志，1963（37）：417

[11] 蕭偉祥.茶紅色素形成機(jī)理和制取[J].茶葉科學(xué)，1997，17（1）：1-8.

[12] 姚立虎，NURSTEN H E.表兒素沒食子酸及表沒食子兒茶素沒食子酸酯單體化學(xué)氧化研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1997，23（5）：21-25.

[13] 谷記平，劉仲華，黃建安，等.單雙液相下不同多酚氧化酶對酶性合成茶黃素的影響[J].茶葉科學(xué)，2007（1）：176-182.