巨桉EgrWOX5基因的克隆、表達(dá)分析與超表達(dá)載體構(gòu)建

徐雙等

摘 要 以巨桉（Eucalyptus grandis）EG5無(wú)性系為試驗(yàn)材料，通過(guò)RT-PCR技術(shù)從中克隆得到了1個(gè)巨桉WOX家族基因成員的CDS序列，命名為EgrWOX5（GenBank登錄號(hào)為KF964019）。該基因全長(zhǎng)為543 bp，編碼181個(gè)氨基酸，具有WOX基因家族最保守的特征結(jié)構(gòu)域-Homeobox domain（HD）結(jié)構(gòu)域；其氨基酸序列與草本植物的擬南芥AtWOX5基因和木本植物楊樹PtrWOX5基因的氨基酸序列有較高的相似性。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，EgrWOX5基因特異性地在巨桉EG5的根組織中表達(dá)。這些結(jié)果間接或直接地說(shuō)明EgrWOX5在巨桉根組織的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究還利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建了EgrWOX5基因的超表達(dá)載體，為后續(xù)基因功能的進(jìn)一步鑒定奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巨桉；WOX5；基因克隆；表達(dá)分析；超表達(dá)載體構(gòu)建

中圖分類號(hào) Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A member of WOX gene family， EgrWOX5（Genbank Accession Number is KF964019）was cloned from Eucalyptus grandis using RT-PCR， which had the most conserved domain-Homeobox domain. The gene is 543 bp and encodes 181 amino acids. The deduced amino acid sequence of EgrWOX5 shares high similarity with AtWOX5 from Arabidopsis thaliana and PtrWOX5 from Populus trichocarpa. Expression analysis revealed its tissue-specific pattern in root. In conclusion， all the results could directly or indirectly prove EgrWOX5 play important roles in the development of root in E. grandis. The study also took advantage of Gateway technology and successfully constructed the over-expression vector of EgrWOX5， which would lay a foundation for further functional study of the gene.

Key words Eucalyptus grandis； WOX5； Molecular cloning； Expression analyses； Over-expression vector construct

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.013

桉樹是桃金娘科（Myrtaceae）桉樹屬（Eucalyptus）植物的總稱，有945個(gè)種，其中有亞種或變種137個(gè)，其樹干通直，纖維細(xì)長(zhǎng)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、輪伐期短、繁殖容易、品種多、病蟲害少等優(yōu)良性狀[1-3]。巨桉（Eucalyptus grandis）為桉樹屬雙蒴蓋亞屬橫脈組柳桉系中的高大喬木，因其樹木高大而得名為“巨桉”[4]。巨桉EG5是優(yōu)良的W. Hill ex Maiden無(wú)性系，具有速生、干形通直、分枝角度小、出材率高等特點(diǎn)，在中國(guó)湖南南部、江西南部、福建中部、廣東等南亞熱帶地區(qū)廣泛栽培[5-6]。

WOX（WUS-related Homeobox）基因家族是一類含有植物特有的同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能，參與莖尖分生組織的維持、胚性的起始和維持、后生器官的起始。擬南芥中，WOX家族包含15個(gè)成員，有3個(gè)Clade：Modern clade包括WUS、WOX1-7；Intermediate clade包括WOX8、WOX9、WOX11、WOX12；Ancient clade包括WOX10、WOX13、WOX14。目前，關(guān)于該家族成員的研究，主要集中于擬南芥[7-8]、矮牽牛[9]、水稻[10]等草本植物中；木本植物中WOX基因的相關(guān)研究較少，只見于云杉[11]中。

迄今為止，已有研究表明WOX5基因維持根尖分生組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性：缺乏WOX5基因的根尖分生組織其遠(yuǎn)端干細(xì)胞進(jìn)行終極分化，而具有WOX5基因功能的根尖分生組織干細(xì)胞終止遠(yuǎn)端干細(xì)胞分化，維持其具有干細(xì)胞特征[12-14]。WOX5在側(cè)根原基起始、生長(zhǎng)過(guò)程中和子葉原基中都有表達(dá)，說(shuō)明WOX5也在這些組織中發(fā)揮作用[15]；此外，還有研究顯示，WOX5和WUS在調(diào)控莖尖和根干細(xì)胞穩(wěn)定時(shí)，二者是可以互換的[16]。鑒于WOX5基因在植物根發(fā)育中發(fā)揮的重要生理學(xué)作用，本研究采用生物技術(shù)手段對(duì)巨桉WOX5基因進(jìn)行克隆、組織表達(dá)分析、超表達(dá)載體構(gòu)建，對(duì)該基因的功能鑒定及從遺傳本質(zhì)上改造桉樹的根發(fā)育特性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巨桉EG5無(wú)性系由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所繁育中心提供。巨桉EG5無(wú)性系的增殖苗接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector與DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TransGen Biotech（Beijing，China）公司。入門載體pDNOR222與超表達(dá)載體pMDC32由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.1.3 引物 利用Primer5.0設(shè)計(jì)巨桉EgrWOX5基因的克隆引物、定量引物、Gateway引物（表1），并委托廣州英濰捷基技術(shù)有限公司（Invitrogen）合成。

1.1.4 主要生化試劑 RNA提取試劑盒為北京艾德萊公司的Aidlab EASYspin植物RNA快速提取試劑盒。反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)New England BioLabs公司的ProtoScript AMV First Strand cDNA Synthesis Kit。電泳染液為美國(guó)MAESTROGEN公司的MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液。超表達(dá)載體構(gòu)建試劑盒為L(zhǎng)ife Technology公司的Gateway反應(yīng)試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 利用Aidlab EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取生根培養(yǎng)30 d巨桉EG5無(wú)性系的根、莖、葉、莖尖及整株植株的總RNA，于2%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 cDNA合成 利用ProtoScript AMV First Strand cDNA Synthesis Kit合成各試驗(yàn)材料RNA的cDNA。反應(yīng)條件為：42 ℃，1 h；80 ℃，5 min。

1.2.3 基因克隆 （1）PCR擴(kuò)增：以EG5總cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)克隆EgrWOX5基因，反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取20 μL PCR產(chǎn)物與1.5 μL MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液混勻，于1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收目的片段。（2）目的片段與T載體連接：將目的片段連接于pEASY-T1 Simple Cloning Vector，反應(yīng)體系為：4 μL PCR產(chǎn)物+1 μL pEASY-T1 Simple Cloning Vector；反應(yīng)條件為：室溫下，反應(yīng)10 min。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。（3）檢測(cè)：挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)與測(cè)序檢測(cè)。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 （1）系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析：通過(guò)Phytozome網(wǎng)站獲得擬南芥WOX基因家族各個(gè)成員的氨基酸序列，利用DNAMAN6.0軟件采用Neighbor-Joining方法（參數(shù)為默認(rèn)值）對(duì)14個(gè)擬南芥WOX基因和巨桉EgrWOX5基因進(jìn)行序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。（2）利用NCBI的Blast工具與COILS軟件（http：//ulrec3.unil.ch/software/COILS_

form.html）對(duì)EgrWOX5基因的DNA序列與氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.5 組織表達(dá)分析 選擇β-Tublin為參照基因，利用半定量PCR分析EgrWOX5基因在不同組織中的表達(dá)情況。半定量PCR反應(yīng)分別以根、莖、葉、莖尖組織的cDNA為模板，反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)。取5 μL PCR產(chǎn)物與0.5 μL MaestroSafe Nucleic Acid Gel Stain Reagent染液混勻，并于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.6 超表達(dá)載體構(gòu)建 按照超表達(dá)載體構(gòu)建流程圖（圖1）構(gòu)建EgrWOX5基因的超表達(dá)載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆

以第一條鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，所獲得目的基因片段位于500～750 bp之間（圖2），經(jīng)測(cè)序分析得出其長(zhǎng)度為543 bp。通過(guò)Blast在線比對(duì)，得知該基因片段與其他已知的WOX基因具有較高的同源性，確定其為WOX基因片段。正確序列提交于GenBank，并獲得EgrWOX5基因的GenBank Accession Number，為KF964019。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 利用Neighbor-Joining法制作擬南芥WOX基因家族14個(gè)成員與巨桉EgrWOX5的進(jìn)化樹構(gòu)建（圖3），結(jié)果表明：已經(jīng)克隆到的EgrWOX5基因與擬南芥AtWOX5和AtWOX7基因相似性最高，分別為73%和58.2%，因此命名該基因?yàn)镋grWOX5。

2.2.2 序列分析 經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析和Blast在線分析結(jié)果（圖4）可知：EgrWOX5基因的CDS序列全長(zhǎng)為543 bp，編碼181個(gè)氨基酸；與擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtWOX5和楊樹（Populus trichocarpa）PtrWOX5基因氨基酸序列的相似性分別為73%和59.3%。

EgrWOX5蛋白均具有WOX基因家族最保守的Homeobox domain（HD）結(jié)構(gòu)域；ERF-associated amphiphilic repression（EAR）motif（序列為L(zhǎng)-[ED]-L-[RST]-L）存在于EgrWOX5蛋白的C端，這與擬南芥AtWOX5蛋白、AtWOX7蛋白相似。

2.3 組織表達(dá)分析

組織表達(dá)分析結(jié)果（圖5）顯示：以EgrTub基因作為參照基因，發(fā)現(xiàn)EgrWOX5只在根中表達(dá)，在其他組織中基本不表達(dá)，說(shuō)明該基因在根組織中具有重要作用。

2.4 超表達(dá)載體構(gòu)建

利用Gateway技術(shù)構(gòu)建EgrWOX5基因的超表達(dá)載體。圖6-A顯示：利用同源重組的方法，將目的基因EgrWOX5與attR1、attR2之間的片段進(jìn)行重組交換，將EgrWOX5基因連接于含有2×35S強(qiáng)啟動(dòng)子的pMDC32超表達(dá)載體上。PCR檢測(cè)超表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果（圖6-B）顯示：目的片段大于500 bp，說(shuō)明超表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

2013年，桉樹基因組全序列測(cè)序的完成[17]，為桉樹基因克隆、功能分析、生物信息學(xué)分析等提供了有利條件。本研究從巨桉EG5無(wú)性系中克隆得到EgrWOX5基因的CDS全長(zhǎng)序列，并利用相似性比對(duì)方法、生物信息學(xué)分析方法和組織表達(dá)分析方法分析了該基因在巨桉EG5生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮的作用。此外，本研究還利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建了EgrWOX5基因的超表達(dá)載體，為該基因后續(xù)的功能鑒定、遺傳性狀改良奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在已有報(bào)道的基因中，WOX基因均具有特征性結(jié)構(gòu)域-Homeobox Domain，包括擬南芥[7-8]、矮牽牛[9]、水稻[10]的WOX基因家族所有成員。序列分析結(jié)果顯示EgrWOX5基因也具有Homeobox Domain結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，Blast在比對(duì)結(jié)果顯示：該基因與擬南芥AtWOX5基因和楊樹PtrWOX5基因具有較高的相似性，分別為73%和59.3%。此外，生物信息學(xué)分析還顯示：EgrWOX5基因具有EAR motif，這與擬南芥AtWOX5基因[18]相似。這些結(jié)果表明本研究克隆出的巨桉EgrWOX5基因是WOX基因家族中的典型成員，并間接證明EgrWOX5基因與已報(bào)到的AtWOX5基因具有相似的生物學(xué)功能，在根組織的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。

組織表達(dá)分析結(jié)果顯示了EgrWOX5基因在根、莖、葉、莖尖不同組織中的表達(dá)情況：EgrWOX5在根中表達(dá)，而在其他組織中基本不表達(dá)，這與擬南芥AtWOX5基因[12-14]和云杉WOX5基因[11]的組織表達(dá)模式相似。該結(jié)果進(jìn)一步證明EgrWOX5基因在巨桉EG5無(wú)性系根的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

WOX基因是多基因家族[7，9-10]，已有研究報(bào)道顯示：同一基因家族中不同成員的表達(dá)模式可能存在很大的差異[11]。本研究只對(duì)巨桉WOX基因家族中的一個(gè)基因的功能進(jìn)行了初步分析與超表達(dá)載體構(gòu)建，目前正在利用超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，旨在深入分析EgrWOX5基因在巨桉根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制。

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