蘇鐵葉枯病病原菌鑒定

李小霞　肖仲久　許艾斌　徐剛紅

摘 要 近年在貴州省蘇鐵各栽培地發(fā)現(xiàn)一種葉枯病害，為明確其致病菌，采集蘇鐵葉枯病葉片樣本數(shù)份，并對病原菌進(jìn)行形態(tài)觀察、致病性測定及rDNA-ITS序列分析。結(jié)果表明：經(jīng)分離純化獲得的病原菌，通過柯赫氏法則，接種后出現(xiàn)的病害癥狀與直接采集到的病害標(biāo)樣癥狀一致，確定其為致病菌；對病原菌進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示病原菌分生孢子器和分生孢子的形態(tài)與擬莖點(diǎn)霉一致；將待測菌株rDNA-ITS序列與GenBank中相關(guān)菌株ITS序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示該菌株與Phomopsis vaccinii（GenBank登陸號為：KC488259，JX846914）的同源性達(dá)97%。結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征及株rDNA-ITS序列（GenBan登錄號：JN417709）特征，確定蘇鐵葉枯病病原菌為Phomopsis cycadis.

關(guān)鍵詞 蘇鐵；擬莖點(diǎn)霉；病原菌

中圖分類號 S791.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Leaf blight on Cycas revoluta Thunb was discovered in Guizhou Province recently. The objective of the study was to identify the pathogen. The Cycas Leaf blight standard samples were collected and the pathogen was identified by morphology， pathogenicity and ribosomal DNA-ITS. The results showed that the isolated fungus was used for departments law of disease and syndrome. Disease symptoms after inoculation were the same as that on the collected samples，which showed the fungus was the pathogen. The pycnidia and conidiamorphology of the pathogen were similar to that of Phomopsis. Comparing the measured sequence with the related sequence of Phomopsis vaccinii（No：KC488259，JX846914） in GenBank， the homology was 97%. According to its characteristics of morphology and sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA（ITS）（No：JN417709）the pathogen was identified as Phomopsis cycadis.

Key words Cycas revoluta Thunb；Phomopsis；Pathogen

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.030

蘇鐵（Cycas revoluta Thunb.）系蘇鐵科蘇鐵屬常綠喬木，起源于3億年前的晚石炭紀(jì)，是現(xiàn)存最古老最原始的種子植物之一[1-3]，是國家一級重點(diǎn)保護(hù)植物，其樹型優(yōu)雅，葉片別致，其性味甘、平、澀，有小毒，具有體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用等，因此，常將其水煎劑用于治療多種腫瘤，是中國傳統(tǒng)觀的賞樹種和藥用植物[4-6]。而隨著蘇鐵的觀賞價值和藥用價值越來越受到人們的重視，其栽植規(guī)模越來越大，隨之而來的是病害的發(fā)生越來越嚴(yán)重，直接影響到植株的生長，進(jìn)而影響其觀賞價值。目前國內(nèi)對于蘇鐵葉枯病的研究多針對炭疽菌（Colletotrichum）和橄欖色盾殼霉（Coniothyrium olivaceum）所致的葉枯病[7-8]，擬莖點(diǎn)霉引起的蘇鐵葉枯病還未見報道。

擬莖點(diǎn)霉屬[Phomopsis（Sacc.）Bubák.]真菌是半知菌亞門腔孢綱真菌。一般侵染植物的葉、枝及果，常引起的植物病害癥狀主要有潰瘍、爛莖、果腐，葉枯、枝枯等[9-10]，危害較大，寄主廣，種類多，但由于種間形態(tài)差異小，常見以寄生植物屬內(nèi)擬莖點(diǎn)霉的形態(tài)比較來進(jìn)行種類鑒定或命名，據(jù)報道該屬寄主植物有74個科136個種[11]。

2009～2013年，在貴州城市蘇鐵盆景、遵義植物園、習(xí)水國家自然保護(hù)區(qū)等地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蘇鐵葉枯病大面積發(fā)生，嚴(yán)重的導(dǎo)致整株枯死。因此，本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)幾年分批采集了上百份自然發(fā)病的標(biāo)樣，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，為蘇鐵葉枯病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本的采集

2009～2013年每年的5～8月，每個采集點(diǎn)（貴州省植物園、遵義植物園、安順市植物園、遵義師范學(xué)院盆景植物園）月均1次，分別采集發(fā)病的蘇鐵葉片標(biāo)樣。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、純化及致病性的測定 采集自然發(fā)病的蘇鐵葉片，以常規(guī)組織法[12]進(jìn)行病原菌的分離。將分離菌株純化后，取健康蘇鐵葉片進(jìn)行室內(nèi)接種試驗(yàn)：將采集的蘇鐵葉片用75%酒精進(jìn)行表面消毒，采用有傷（刺傷法）接種和無傷接種2種方法，每個葉片接種2個接種點(diǎn)，每個供試菌株接種3片葉片。實(shí)驗(yàn)組接種已純化的5 mm的菌餅，對照組接種5 mm無菌的PSA培養(yǎng)基，將其置于鋪有濕潤吸水紙的培養(yǎng)皿中，于25 ℃、光照1 500 lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察接種結(jié)果，并對接種成功的病斑進(jìn)行組織分離，以確認(rèn)致病菌株[4]。

1.2.2 病原菌的孢子、菌絲形態(tài)觀察及形態(tài)學(xué)鑒定 按照柯赫氏法則，在確定致病性后，用針尖從標(biāo)本上挑取小黑點(diǎn)（分生孢子器），在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)，并測量其大小。25 ℃、PSA平板上培養(yǎng)菌株數(shù)天，記錄菌落的培養(yǎng)性狀。

1.2.3 病原菌DNA提取 DNA的提取，參照Sharp等[13]、Xiao等[14]的方法，并略有改進(jìn)。取約0.2 g菌絲，置于預(yù)冷的研缽中，加入少許石英砂研磨至粉狀，再加入600 μL的2% CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動后，置于2 mL的滅菌離心管中，65 ℃的水浴30～60 min，期間每隔10 min上下輕輕顛倒，混勻離心管內(nèi)的緩沖液1～2次；冷卻2 min后，加入（酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇）（V∶ V ∶ V 25 ∶ 24 ∶ 1）至滿管，使二者混合均勻，4 ℃離心（12 000 r/min）10 min；重復(fù)該步驟2～3次直至水相與有機(jī)相中間層無雜質(zhì)；離心后取上清液至新離心管內(nèi)，加入600 μL預(yù)冷的異丙醇，慢慢上下?lián)u勻30 s，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；置于4 ℃離心（12 000 r/min）， 10 min后，棄上清液，晾干；加入1 mL 75%乙醇漂洗DNA，7 500 r/min再離心5 min，倒掉上清液，室溫晾干；加入30 μL無菌水，4 ℃過夜溶解后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 rDNA-ITS區(qū)域核苷酸序列測定 選用真菌ITS擴(kuò)增的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行

配對擴(kuò)增[14]（引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Tiangen的DNA凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將測得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行同源性分析，分析后向GenBank提交序列，再從GenBank中選取合適的序列，經(jīng)CLUSTALW 2.0軟件進(jìn)行序列對比，并用MEGA 5.05軟件采用鄰接法（Neighbor-joining analysis，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

將采集的樣本經(jīng)分離純化后，共獲得蘇鐵葉部病原菌菌株15株，編號為P01-15。其中，P01、04、08、09回接后為非致病菌，其它菌株形態(tài)特征基本一致，選取菌株P(guān)03為代表（標(biāo)本采自遵義植物園），按柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定和病原菌鑒定。

2.2 致病性的測定

接種48 h后，刺傷接種處出現(xiàn)褐色水漬狀病斑；隨著接種時間的延續(xù)，褐色水漬狀病斑上下擴(kuò)展；接種后第8天，葉片出現(xiàn)干枯；接種后第13天，出現(xiàn)埋生的黑色分生孢子器；接種15 d后，人工接種葉片幾乎全葉變?yōu)楹稚▓D1），與自然發(fā)病癥狀一致。對其進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，其分離物與接種供試菌株培養(yǎng)性狀相同，由此可見，供試菌株為蘇鐵葉枯病的致病菌。無傷接種和對照接種后無病斑出現(xiàn)。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)的鑒定

自然發(fā)病的病葉一般發(fā)生在葉尖或中部，初為梭形、圓形、不規(guī)則形，黃褐色，邊緣灰白色，逐漸向葉柄擴(kuò)展，引起葉尖干枯，后期病部散生黑色小點(diǎn)（分生孢子器）（圖2）。分生孢子器球狀至扁球形，埋生于葉面，大小為255～423 μm（n=30），器壁黑褐色，孔口明顯（圖3），分生孢子梗無色、分隔、簇狀或合軸分枝，11～25×1.7～2.6 μm。輕輕壓迫分生孢子器，內(nèi)涌出甲型（α型）分生孢子，無色，紡錘形，單胞，內(nèi)含1～3個油球，一般為2個，大小為5.14～10.8×1.9～4.4 μm（n=30）（圖4）。寄主植物上未分離到乙型（β型）分生孢子。新鮮標(biāo)樣進(jìn)行分離純化后，在25 ℃、PSA培養(yǎng)4 d后，菌絲輻射狀生長，菌絲的正反面均為白色、絨毛狀，菌絲平板上呈現(xiàn)“深-淺-深”的輪紋（圖5）；6 d后菌絲的反面出現(xiàn)輪狀黑色小點(diǎn)（圖6）；15 d后正面出現(xiàn)黑點(diǎn)狀的分生孢子器（子實(shí)體），排列在同心圓的邊緣（圖7）。30 d后黑色的子實(shí)體中噴射出黃色的分生孢子，取其黃色分生孢子置于玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子性狀。分生孢子器內(nèi)產(chǎn)生2種類型的分生孢子，除有在寄主上看到的無色的甲型分生孢子外，還有乙型分生孢子，無色，線性，內(nèi)無油球，單胞，有些一端彎曲呈鉤狀，有些稍有彎曲，大小為15.36～51.2×0.7～1.28 μm（n=30）（圖8），經(jīng)初步形態(tài)鑒定為擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis真菌。

2.4 rDNA-IT區(qū)域核苷酸序列的測定與分析

菌株用ITS區(qū)域通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果可得到1條600 bp左右的條帶（圖9），回收目的片段進(jìn)行測序，結(jié)果大小為527 bp。將測序得到的序列與GenBank中已有的DNA序列進(jìn)行同源性比對，菌株P(guān)03（GenBan登錄號：JN417709）與分離自中國山東的藍(lán)莓?dāng)M莖點(diǎn)枝枯病病原菌Phomopsis vaccinii（GenBank登陸號為：KC488259，JX846914）同源性最高，達(dá)97%，分值為891。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，在以Leucostoma curreyi（Accession No. AF191172）為外群構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，目標(biāo)病原菌與分離自藍(lán)莓的擬莖點(diǎn)霉菌株遺傳距離最近（圖10）。但蘇鐵葉枯病病原菌并非P. vaccinii，結(jié)果鑒定為蘇鐵擬莖點(diǎn)霉Phomopsis cycadis。

3 討論與結(jié)論

擬莖點(diǎn)霉是重要的植物內(nèi)生真菌和資源真菌，但也是一種重要的植物病原真菌，諸多報道其引起多種植物葉、莖、枝等病害[7-8，15]。為明確引起貴州蘇鐵葉枯病病原菌，本課題組通過病原菌培養(yǎng)特性觀察，確認(rèn)引起貴州省蘇鐵葉枯病病原菌為擬莖點(diǎn)霉Phomopsis屬真菌，國外曾經(jīng)有關(guān)于蘇鐵葉枯病方面的報道，對該病的病原菌也有不同的報道，有刺盤孢Colletotrichum sp.、擬莖點(diǎn)霉Phomapsis、擬盤多毛孢Pestalopsis sp.。Phomopsis cycadis最初發(fā)表于1954年[16]，在此之前一直采用莖點(diǎn)霉Phoma cycadis[17]，國內(nèi)幾乎無擬莖點(diǎn)霉Phomapsis引起的蘇鐵葉枯病病原菌的報道。通過 rDNA ITS 序列比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病原菌與分離自山東的2株P(guān). vaccinii同源性最高（97%）。rDNA-ITS 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，P. cycadis和P. vaccinii分處于不同的分支，支持率達(dá)98%，同時比較兩者的致病性特點(diǎn)及病原菌形態(tài)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者差異明顯，P. vaccinii的分生孢子器直徑一般 300～500 μm，甲型分生孢子大小為 6～11×2～5 μm[18-19]，比本菌分生孢子器大，而且其甲型分生孢子稍寬，因此，可判別蘇鐵葉枯病病原菌并非P. vaccinii。另外，P. vaccinii主要寄生于杜鵑花科越桔屬藍(lán)莓（Vaccinium）植物上，可通過花芽和傷口侵入。本研究在病原菌致病性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，傷口對于P. cycadis入侵寄主尤為重要，無傷接種無病斑出現(xiàn)，因此，在蘇鐵的栽培中，農(nóng)事操作過程減少造成蘇鐵葉片傷口是減少該病菌危害的重要手段。

因此，基于病原菌形態(tài)特征和rDNA ITS序列分析，將引起貴州遵義等地的蘇鐵葉枯病的病菌鑒定為蘇鐵擬莖點(diǎn)霉P. cycadis。

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