木薯細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶玀eCWINCV5基因啟動子的克隆和序列分析

夏文睿等

摘要 [目的]了解MeCWINCV5在植物生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和逆境脅迫應(yīng)答中的功能。[方法]采用PCR方法從木薯基因組中分離MeCWINCV5基因啟動子序列，考察MeCWINCV5對植物生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和逆境脅迫應(yīng)答的影響。[結(jié)果]分析顯示啟動子的長度為1 170 bp，含有TATA box和CAAT box等多個典型的真核生物啟動子基本元件元件，還存在大量逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的順式調(diào)控元件，如HSE、MBS、SARE、GAREmotif和TATC-box等多個與植物逆境脅迫相關(guān)的元件。[結(jié)論]MeCWINCV5基因啟動子與逆境脅迫有關(guān)，在木薯抵御逆境脅迫的生理過程中具有重要作用。

關(guān)鍵詞 木薯；細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶；啟動子；逆境脅迫；順式調(diào)控元件

中圖分類號 S632 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03179-03

Abstract [Objective] In order to study the promoter MeCWINCV5 in cassava which play important roles in plant growth and development，hormone regulations and stress responses.[Method] An 1 170 bp promoter region upstream of the MeCWINCV5 gene was isolated from cassava genomic DNA using PCR methods.[Result] Sequence analysis found that it contains a typical TATA box and CAAT box，and several cisacting elements that relate plant stress responses，such as HSE，MBS，SARE，GAREmotif，TATCbox transcription factor.[Conclusion] It is suggested that MeCWINCV5 gene may play important roles in response to various stresses.

Key words Cassava； Cell wall acid invertase； Promoter； Stress responsiveness； Cisacting element

木薯是全球最重要的糧食作物之一，但是塊根中積累的淀粉含量遠遠低于理論產(chǎn)量。蔗糖在淀粉積累過程中作為溝通源器官和庫器官的橋梁，而在源葉中合成的蔗糖從葉（源）到塊根（庫）的長途運輸過程主要由蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）來調(diào)控完成[1-3]。蔗糖轉(zhuǎn)化酶根據(jù)其最適pH值分為中性轉(zhuǎn)化酶 （neutral invertase，NI）和酸性轉(zhuǎn)化酶 （acid invertase，AI）[4]。細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖的分解是韌皮部卸載的關(guān)鍵步驟[5]。在庫器官中提高細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶的活性有利于蔗糖在庫器官中的積累，也是植物源庫器官蔗糖代謝的關(guān)鍵酶[6]。研究者通過研究木薯細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因啟動子上的生長激素相關(guān)元件和逆境相關(guān)反應(yīng)元件與啟動子的相互作用來探討木薯細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因啟動子對轉(zhuǎn)化酶基因的調(diào)控作用[7]。筆者采用PCR方法從木薯基因組中分離MeCWINCV5基因啟動子序列，考察MeCWINCV5對植物生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和逆境脅迫應(yīng)答的影響，以期為MeCWINCV5的合理開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 華南木薯8號，由實驗室采購。

1.2 方法

1.2.1 華南木梳8號基因組DNA的提?。–TAB 法）[8]。取 1.000 g經(jīng)暗培養(yǎng) 2～3 d的幼嫩木薯葉片（去葉脈），經(jīng)液氮研磨后加入預(yù)熱至65 ℃的CTAB提取緩沖液中提取，上清液加等體積氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）混勻后離心；上清液用等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V/V）和氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）反復(fù)抽提。加入1/10體積NaAc（3 mol/L，pH5.2）和2倍體積冷乙醇以沉淀 DNA（2 h），分別用70%、80%乙醇洗滌沉淀并加入100 μl TE緩沖液回溶DNA沉淀，同時加入2 μl RNase，置37 ℃處理2 h。再用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V/V）和氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）分別抽提，吸取上清液，重新沉淀DNA，用濃度70%乙醇，清洗風(fēng)干，加入適量體積的去離子水回溶。

1.2.2 木薯細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶MeCWINCV5基因啟動子。根據(jù)課題組已經(jīng)克隆得到的木薯細胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因MCWINV5序列（GeneBank：X291159）和phytozome植物基因序列預(yù)測庫的木薯MCWINV5基因序列，設(shè)計引物如下，CW5F：5ATGAGCTCTAATGCAGTCCGAC

AC3和CW5R： 5GTGGATCCGATCGAAGAAAAAAG3，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火延伸150 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 生物信息學(xué)分析。將測序得到的片段序列與MeCWINCV5基因的序列比對，確定擴增的啟動子序列的正確性。利用PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）和PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件分析啟動子序列，預(yù)測順式作用元件位點[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子片段的擴增與克隆 根據(jù)已經(jīng)克隆得到的木薯細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV5（GeneBank：X291159）序列和phytozome植物基因序列預(yù)測庫的木薯MeCWINV5基因序列設(shè)計引無為CW5F：5ATGAGCTCTAATGCAGTCCGACAC3和CW5R：5GTGGATCCGA TCGAAGAAAAAAG3，從華南8號木薯組培苗中擴增得到一段長為1 300 bp的序列，命名為cw5（圖1）。將片段與pMD19T進行連接，通過菌液PCR，篩選獲得陽性單克隆測序后，將其與MeCWINV5基因CDs區(qū)序列和phytozome植物基因序列預(yù)測庫中相應(yīng)序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此片段含有MeCWINV2基因從ATG起始的長為130 bp的CDs序列和ATG上游長為1 170 bp的潛在啟動子序列（圖2）。

3 結(jié)論與討論

試驗采用PCR的方法對華南木薯8號MeCWINV5基因啟動子進行了克隆，得到一段長為1 170 bp的啟動子序列，對該片段序列進行分析，發(fā)現(xiàn)此片段上含有CAAT box和TATA box等多個典型的真核生物啟動子元件，并且含有熱脅迫響應(yīng)的答元件HSE，干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS，水楊酸響應(yīng)元件SARE，赤霉素反應(yīng)元件GAREmotif、TATCbox和脅迫防御元件TCrich repeats等多個順式作用元件。在擬南芥[10]，煙草[11]，大豆[12]等植物轉(zhuǎn)化酶基因啟動子已驗證上述激素調(diào)控和脅迫，由此可以看出MeCWINV5可能參與多種信號傳播，并且在木薯逆境脅迫應(yīng)答中起到了重要作用。由于細胞壁轉(zhuǎn)化酶MeCWINV5基因在植物生命活動中和逆境脅迫起到越來越重要的作用，而被人們所關(guān)注，近年來關(guān)于細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因的研究有了一定的進展，但是大部分停留在對啟動子的克隆以及序列分析階段，其作用機制依然空缺，啟動子在基因上游部分，調(diào)控基因的表達，預(yù)測基因的功能，如果能進一步對啟動子序列進行研究，就可以為研究基因功能和啟動子作用元件分析提供方向和依據(jù)。

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