分子標(biāo)記在我國紅豆杉科保護(hù)植物中的應(yīng)用

毛慶家

摘 要： 簡述了我國紅豆杉科保護(hù)植物的種類，對幾種DNA分子標(biāo)記技術(shù)在紅豆杉科保護(hù)植物中的應(yīng)用，特別是對紅豆杉屬植物在遺傳多樣性、分類學(xué)、性別鑒定、特定性狀的連鎖標(biāo)記、分子標(biāo)記的開發(fā)等方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述，同時(shí)指出了今后分子標(biāo)記應(yīng)用的重點(diǎn)。

關(guān)鍵詞： 紅豆杉科；保護(hù)植物；分子標(biāo)記

中圖分類號：S791.49 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1004-3020（2014）04-0023-06

分子標(biāo)記自問世以來短短幾十年已發(fā)展到數(shù)10種。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測的序列或蛋白質(zhì)，而狹義的分子標(biāo)記僅指DNA標(biāo)記?，F(xiàn)有的DNA分子標(biāo)記可分為三類：第一類是通過限制性酶切消化結(jié)合Southern雜交技術(shù)獲得的標(biāo)記，如RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）標(biāo)記[1]。第二類是通過PCR擴(kuò)增獲得的標(biāo)記，如RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）標(biāo)記[2]。第三類是通過限制性酶消化和PCR擴(kuò)增相結(jié)合所獲得的標(biāo)記，如AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）標(biāo)記[3]。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物有無特異性，基于PCR 的分子標(biāo)記又可分成特異標(biāo)記和非特異標(biāo)記2類。常用的非特異標(biāo)記有RAPD、AFLP、ISSR（簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增） [4]和SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）[5]，特異標(biāo)記有SSR（簡單序列重復(fù)）[6]等。本文主要闡述了這幾種分子標(biāo)記在紅豆杉科保護(hù)植物中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 我國紅豆杉科保護(hù)植物的種類

紅豆杉科有5個(gè)屬，分別是穗花杉屬、榧樹屬、澳洲紅豆杉屬、白豆杉屬和紅豆杉屬。除澳洲紅豆杉屬生長在南半球外，其余均產(chǎn)自北半球，分布于歐亞和美洲大陸的寒溫帶、溫帶和亞熱帶地區(qū)。紅豆杉科紅豆杉屬植物為針葉樹類植物，通常認(rèn)為世界上有9個(gè)種，我國共有3 種2 變種，分別是東北紅豆杉Taxus cuspidata、密葉紅豆杉T. fuana、須彌紅豆杉T. wallichiana、紅豆杉T. wallichiana var. chinensis和南方紅豆杉T. wallichiana var. mairei，均為珍稀瀕危保護(hù)植物[7]。

紅豆杉屬植物集藥用、材用和觀賞等于一體，尤其是其樹皮、枝葉中含有抗癌特效藥物紫杉醇而非常珍貴。紫杉醇是目前世界上最好的抗癌藥物，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值。為保護(hù)紅豆杉屬自然資源免遭滅絕，根據(jù)國務(wù)院1999年8月4日批準(zhǔn)的國家林業(yè)局、農(nóng)業(yè)部申報(bào)的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）》，紅豆杉科國家Ⅰ級保護(hù)植物有：臺灣穗花杉Amentotaxus formosana、云南穗花杉A.yunnanensis、紅豆杉屬所有種Taxus spp.；國家Ⅱ級保護(hù)植物有：白豆杉Pseudotaxus chienii、榧屬所有種Torreya spp.。

2 常用分子標(biāo)記在紅豆杉科國家保護(hù)植物中的應(yīng)用2.1 RFLP標(biāo)記

紅豆杉科在我國有4個(gè)屬即紅豆杉屬、白豆杉屬、穗花杉屬和榧樹屬，它們均是研究裸子植物系統(tǒng)發(fā)育的重要材料。王艇等[8]通過對rbcL基因進(jìn)行PCR-RFLP 分析對紅豆杉科的一些基本系統(tǒng)學(xué)問題進(jìn)行了研究，結(jié)果表明紅豆杉科是一自然的單系群得到了RFLP標(biāo)記的有力支持；紅豆杉屬構(gòu)成了穗花杉屬、白豆杉屬和榧樹屬的姊妹群；穗花杉屬和白豆杉屬宜置于紅豆杉科內(nèi)處理為屬，不贊同將這兩個(gè)屬分別獨(dú)立成科的觀點(diǎn)；白豆杉屬同榧樹屬的關(guān)系密切。

2.2 RAPD標(biāo)記

2.2.1 遺傳多樣性研究

張宏意等[9]基于RAPD 分子標(biāo)記對廣東、湖南和江西12 個(gè)南方紅豆杉自然居群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，從100 個(gè)引物中共篩選出10個(gè)，獲得譜帶86條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）占51.16%，粵北9個(gè)居群的遺傳多樣性較低。聚類分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地個(gè)體間的遺傳距離較大。

蘇建榮[10]采用RAPD技術(shù)對須彌紅豆杉遺傳多樣性進(jìn)行了研究，PPB值高達(dá)93.72%，僅低于曼地亞紅豆杉（94.9%）[11]，而高于南方紅豆杉（51.16%）[9]、歐洲紅豆杉（82.92%）[12]、加拿大紅豆杉（20.6%）[11]、歐洲紅豆杉（86.5%）[11]、東北紅豆杉（76.84%）[11]。

茹文明等[13]采用RAPD 技術(shù)檢測了山西南部南方紅豆杉8個(gè)種群的遺傳多樣性。21個(gè)引物共檢測出134個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)123個(gè)，占91.79%。南方紅豆杉種群內(nèi)平均遺傳多樣性為1.493，總的遺傳多樣性平均為2.180，在總的遺傳變異中，大部分存在于種群內(nèi)（68.3%），種群間占31.7%。在南方紅豆杉種群總的遺傳變異中，種群內(nèi)個(gè)體的遺傳變異大于種群間個(gè)體的遺傳變異。

鄭超等[14]采用RAPD標(biāo)記研究了分屬于4 種紅豆杉屬植物的68個(gè)單株的遺傳多樣性，南方紅豆杉的多態(tài)性條帶百分率最高，達(dá)56.0%，而須彌紅豆杉的多態(tài)性條帶百分率最低，為43.1%。南方紅豆杉和須彌紅豆杉的遺傳距離最近，為0.289 3，這一研究結(jié)果支持在Flora of China[7]中將南方紅豆杉作為是須彌紅豆杉1個(gè)變種的分類處理，

2.2.2 遺傳分化研究

王艇等[15]用20個(gè)RAPD標(biāo)記引物對國家二級保護(hù)植物白豆杉11 個(gè)種群共計(jì)91個(gè)體的DNA 樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到264條譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出13.20條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為76.14 %。根據(jù)白豆杉種群RAPD 數(shù)據(jù)矩陣計(jì)算出的Nei基因分化系數(shù)GST值為0.586 5，表明白豆杉種群間發(fā)生了極其顯著的遺傳分化。

由于白豆杉種群間已發(fā)生高度遺傳分化，所以建議在保育過程中盡量避免在種群之間實(shí)施種質(zhì)遷移，最好不在分化顯著的種群間人為移栽個(gè)體。

2.2.3 親緣關(guān)系研究

李斌連[16]利用RAPD標(biāo)記從64個(gè)RAPD引物中篩選出有帶的引物9個(gè)，檢測出的多態(tài)性條帶占總條帶數(shù)的比例（PPB）約為27%，說明紅豆杉屬植物之間的遺傳差異不大。通過聚類分析，栽培的密葉紅豆杉和栽培的曼地亞紅豆杉（Taxus ×media）的遺傳上較為相似，與南方紅豆杉親緣關(guān)系次之；而南方紅豆杉各變種間親緣關(guān)系因取材地域不同也有一定的差異。

2.2.4 分子系統(tǒng)學(xué)研究

王艇等[17]采用RAPD技術(shù)研究了紅豆杉科植物紅豆杉、南方紅豆杉、白豆杉、穗花杉Amentotaxus argotaenia 、云南穗花杉和云南榧樹Torreya yunnanensis等6種植物，在分子水平上對紅豆杉科植物的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了探討。RAPD分析表明， 紅豆杉與南方紅豆杉的遺傳距離較?。?.121）， 從聚類分析的結(jié)果可見在種一級的水平上其遺傳分化是非常小的，不支持將紅豆杉再分為兩個(gè)獨(dú)立種的意見。

王貴榮等[18]利用RAPD進(jìn)行多態(tài)性檢測，參試的6 種紅豆杉的多態(tài)性條帶占總條帶數(shù)的比例（PPB）約為44.8%，說明供試紅豆杉材料的遺傳基礎(chǔ)較窄，各個(gè)種之間的遺傳分化比較小，但它們的染色體數(shù)完全一致，2n=24條。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉與中紅豆杉的親緣關(guān)系最近， 這與中國植物志[19] 將南方紅豆杉作為紅豆杉的一個(gè)變種相一致。

2.2.5 與紫杉醇含量相關(guān)的RAPD連鎖標(biāo)記研究

陳毓亨等[20]最早做了南方紅豆杉紫杉烷含量與RAPD相關(guān)性分析研究。在RAPD標(biāo)記中，紫杉醇高含量樣品具有區(qū)別于所在地區(qū)其他個(gè)體的擴(kuò)增條帶，如峨眉山有30條，云南有15條，武寧僅4條。云南和峨眉山的2個(gè)樣品一定程度上似與它們的形態(tài)差別有一定的聯(lián)系。而武寧2個(gè)樣品的形態(tài)和生態(tài)與所在地區(qū)其他樣品沒有區(qū)別，但在DNA條帶上有一定差異。因此，這些條帶已在一定程度上排除了形態(tài)和生態(tài)的影響。21個(gè)引物中，有9個(gè)引物出現(xiàn)僅見于兩個(gè)地區(qū)間（如四川與云南或云南與江西）高含量紫杉烷樣品的共同的特征性條帶。RAPD擴(kuò)增結(jié)果的UPGMA 聚類分析也表明，這7個(gè)樣品都分別與所在地區(qū)內(nèi)其他個(gè)體有一定的遺傳距離，說明這些高含量樣品都不同程度地從地區(qū)中分化出來，各自形成自己的分子特征。就上述初步研究而言，在南方紅豆杉中至少存在3個(gè)高含量紫杉烷植株系。

蘇建榮等[21]對所有采樣的須彌紅豆杉植株開展了RAPD標(biāo)記與不同器官紫杉醇含量的關(guān)聯(lián)研究。篩選出了指示樹皮、小枝、針葉紫杉醇低含量的RAPD 特異性條帶分別為4 條、2 條和5 條；指示樹皮和針葉紫杉醇次低含量的特異性條帶各1條。利用它們可縮小高含量紫杉醇植株的篩選范圍，減少篩選成本和工作量，具有一定的生產(chǎn)意義。而與陳毓亨等[20]的南方紅豆杉研究結(jié)果不同，須彌紅豆杉未篩選出指示紫杉醇高含量的特異性RAPD標(biāo)記。

2.3 AFLP標(biāo)記

2.3.1 遺傳多樣性和遺傳分化研究

江建銘等[22]應(yīng)用AFLP標(biāo)記方法對（南方）紅豆杉種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，從32對引物組合中篩選了10對引物組合，共擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)107個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)占總擴(kuò)增位點(diǎn)的比例平均為78.1%。

同年，于曉芹等[23]應(yīng)用AFLP標(biāo)記方法，得出不同居群的多態(tài)位點(diǎn)比例從27.32%～41.53%（PPB）。AMOVA分析結(jié)果表明：須彌紅豆杉居群間的變異是居群內(nèi)變異的2倍（各居群間變異占66.70%，居群內(nèi)變異占33.30%），表明須彌紅豆杉居群變異成分主要發(fā)生在居群間；各居群間的遺傳分化系數(shù)Fst為0.67，表明居群間的遺傳分化極顯著。PopGene所得基因分化系數(shù)Gst為0.554 5 （低于Fst值）同樣表明居群間的遺傳分化極顯著。

2.3.2 性別鑒定研究

肖璐等[24]利用AFLP技術(shù)，從64對引物組合中篩選出了7對引物組合，在雌雄基因池中表現(xiàn)出差異，共擴(kuò)增出11條差異性條帶，其中在雄株中只擴(kuò)增出1條差異性條帶，在雌株上擴(kuò)增出10條差異性條帶，但這11個(gè)與性別相關(guān)的AFLP標(biāo)記，其DNA序列能否作為候選有價(jià)值的性別鑒定探針或發(fā)展為PCR引物，還需進(jìn)一步深入研究。

2.4 ISSR標(biāo)記

ISSR標(biāo)記在南方紅豆杉中的應(yīng)用僅限于其遺傳多樣性和遺傳分化的研究。

張蕊等[25 ]利用8個(gè)ISSR引物對15個(gè)種源的南方紅豆杉進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測到90個(gè)位點(diǎn)，其中89個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為98.89%，說明其在物種水平上的遺傳多樣性豐富。南方紅豆杉種源遺傳多樣性受其產(chǎn)地經(jīng)度和緯度非線性共同影響，偏南和偏西地區(qū)種源的遺傳多樣性較低，偏東和偏北地區(qū)種源遺傳多樣性則較高。因試驗(yàn)的南方紅豆杉種源其原產(chǎn)地種群皆是較大的古樹群， 片斷化的時(shí)間較短， 加上其特有的繁育特性， 種源間基因分化系數(shù)為0.121 1，僅有8.75%的遺傳變異存在于種源間，而91.25%的遺傳變異來自于種源內(nèi)。

李乃偉等[26]采用ISSR 標(biāo)記技術(shù)對南方紅豆杉遷地保護(hù)小種群及其衍生自然種群5個(gè)小斑塊（小居群） 的遺傳多樣性行了分析。從90條引物中共篩選出10 個(gè)多態(tài)性引物，獲得ISSR 譜帶102條，其中多態(tài)性譜帶74條，占72.54%。聚類分析結(jié)果表明：南方紅豆杉遷地保護(hù)各自然小居群間的遺傳距離與這些居群的地理生境有關(guān)， 而與地理距離并沒有顯著相關(guān)性。其主要原因是各小居群為衍生自然居群內(nèi)部的分區(qū)， 雖呈斑塊分布但未形成嚴(yán)格的區(qū)域隔離，可以視為一個(gè)居群整體，從而與針對具有嚴(yán)格區(qū)域隔離的大范圍的植物居群的分析結(jié)果有所不同。

李乃偉等[27]采用ISSR 標(biāo)記方法，對南方紅豆杉3個(gè)野生種群、2個(gè)遷地保護(hù)栽培種群及2個(gè)遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析和比較。合并后的遷地保護(hù)衍生種群以及野生種群均有較高的遺傳多樣性，二者的PPB值相近，分別為78.08%和82.19%。這表明在植物園次生林環(huán)境條件下，回歸到自然生境下的南方紅豆杉遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性趨于豐富并接近野生種群，從而證明了植物園在瀕危植物遷地保護(hù)中具有以往未被認(rèn)識到的巨大潛力。為使植物園保護(hù)的植物小種群能夠長久繁衍，在建立一個(gè)新的植物園之初，就應(yīng)考慮供游人參觀的開放區(qū)與供植物種群繁衍擴(kuò)張的自然區(qū)的結(jié)合。

丁桂生[28]利用ISSR分子標(biāo)記對來自10省區(qū)15個(gè)南方紅豆杉種源共300株個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測到90個(gè)位點(diǎn)， 其中89個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為98.89%，表明南方紅豆杉物種水平上的遺傳多樣性豐富。AMOVA分析結(jié)果顯示，南方紅豆杉種源間的遺傳變異較小，僅占總變異的8.75%，這是因?yàn)槟戏郊t豆杉為風(fēng)媒異花授粉樹種，傳粉能力強(qiáng)，其種子具有紅色帶甜味的肉質(zhì)假種皮，可借助鳥及鼠類的吞食而得以遠(yuǎn)距離傳播，原有種群間的基因交流頻繁，加之現(xiàn)有保留種群片斷化的時(shí)間較短，未發(fā)生嚴(yán)重的遺傳分化。

2.5 SRAP標(biāo)記

任娜[29]首先利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法對20株來自南方紅豆杉和須彌紅豆杉的供試菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果顯示：20株供試菌株被分為4類。

為了篩選出更優(yōu)良的紫杉醇產(chǎn)生菌，采用了相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)對20株紅豆杉內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示：24對SRAP引物共擴(kuò)增出584條帶，其中多態(tài)性條帶446條，多態(tài)性比率為76.4%。

在以相似系數(shù)0.601為閾值時(shí)，SRAP標(biāo)記可將20株菌株分為4類，與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類相比較，SRAP技術(shù)能將20株真菌更準(zhǔn)確的區(qū)分開來。

2.6 RAPD和ISSR標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用

張玲玲[30]運(yùn)用RAPD標(biāo)記對23個(gè)種源的南方紅豆杉遺傳多樣性進(jìn)行研究，篩選出的13個(gè)引物擴(kuò)增出147條清晰帶，其中多態(tài)性帶136條，多態(tài)性條帶比率為92.52%，表明南方紅豆杉具有較高的遺傳多樣性。

ISSR標(biāo)記使用12條引物對23個(gè)種源的南方紅豆杉進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增145條清晰帶，其中多態(tài)性帶140條，96.55%的多態(tài)性條帶比率高于目前已報(bào)道的其它作物。遺傳相似性分析發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉種源遺傳多樣性較為豐富。

2.7 SSR標(biāo)記的開發(fā)研究

吳瓊[31]在東北紅豆杉針葉454測序結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)了753個(gè)簡單重復(fù)序列（SSR）模體，大約85%的SSR模體長度在14～24 bp之間，SSR模體的分布密度為平均12.47 kb編碼區(qū)有一個(gè)簡單重復(fù)序列，頻率為3.1%。六核苷酸有260種，約占34.5%，是最豐富的模體。其次為三核苷酸，有242種，約占32.1%，可見六核苷酸和三核苷酸構(gòu)成了總的微衛(wèi)星標(biāo)記的一多半。

易官美等[32]利用基因組勘測序列（GSS序列）探討開發(fā)南方紅豆杉SSR標(biāo)記的可行性。從1923條GSS序列中搜尋到184個(gè)SSR位點(diǎn)。其中二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重復(fù)所占比例分別為88.6%、10.3%和1.1%。根據(jù)所獲得的184個(gè)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，最終獲得90個(gè)候選SSR引物，并用南方紅豆杉進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果所有的引物都能獲得穩(wěn)定清晰的條帶。驗(yàn)證結(jié)果表明，所開發(fā)的SSR 標(biāo)記在基因組中的擴(kuò)增結(jié)果多表現(xiàn)為清晰可讀的單一主帶，表明這些標(biāo)記在基因組中的位置是特異的，能夠有效地反映基因組的多態(tài)性，可以成為種子種苗鑒定及分子生物學(xué)等相關(guān)研究的有力工具。同時(shí)該研究結(jié)果也表明GSS數(shù)據(jù)可以有效地用于SSR標(biāo)記的挖掘，為那些不具備全基因組數(shù)據(jù)的物種開發(fā)分子標(biāo)記提供了新途徑。

李炎林等[33]利用Trinity軟件對NCBI公共數(shù)據(jù)庫中南方紅豆杉根、莖、葉的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的重新拼接。通過SSR檢測程序從96 279條Unigenes中得到2 160個(gè)SSR位點(diǎn)（2.24%），其平均發(fā)生率為1/18.01 kb，基序長度為14～25 bp之間。優(yōu)勢重復(fù)基序?yàn)榱塑账岷腿塑账?，分別占總SSR 位點(diǎn)的38.56%和37.08%。2 160個(gè)SSR 位點(diǎn)由703 種重復(fù)基序構(gòu)成，其中六核苷酸占60.96%，二、三核苷酸占總SSR 位點(diǎn)的44.81%。隨機(jī)挑選62 對SSR引物對8個(gè)南方紅豆杉株系進(jìn)行了SSR擴(kuò)增，有效擴(kuò)增率為53.23%，多態(tài)性比率為38.71%。

3 展望

SRAP是一種新型的基于PCR的非特異標(biāo)記標(biāo)記技術(shù)，與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比較，具有產(chǎn)率高、多態(tài)性高、共顯性高、重復(fù)性好，在基因組中分布均勻，較易測序，便于克隆目標(biāo)片段，操作簡單，引物具有通用性，且其正、反引物兩兩搭配組合，提高了引物的使用率，降低成本。因此，SRAP也可用于紅豆杉屬植物的遺傳多樣性研究等。

在紅豆杉科保護(hù)植物中所用到的分子標(biāo)記大都局限于RAPD和ISSR等，其穩(wěn)定性和重現(xiàn)性一直備受質(zhì)疑。特異性分子標(biāo)記具有重現(xiàn)性好，擴(kuò)增靶序列在基因組中位置確定等優(yōu)點(diǎn)，因而倍受研究者青睞。最常用的特異標(biāo)記是SSR。近年來，許多植物中都開展了表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的測序工作，互聯(lián)網(wǎng)上有關(guān)數(shù)據(jù)庫中積累了大量的EST序列數(shù)據(jù)。從這些數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)，在EST序列中也存在SSR位點(diǎn)。因此，人們試圖利用EST序列開發(fā)SSR標(biāo)記，稱為EST-SSR標(biāo)記。

基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序得到的序列，目前互聯(lián)網(wǎng)上已登錄了一些的南方紅豆杉GSS 序列。GSS序列是NCBI的一部分，已經(jīng)整合到了GenBank中，與EST數(shù)據(jù)庫類似。區(qū)別在于GSS序列是從全基因組序列克隆兩端獲得的短的部分序列，而不是從cDNA 文庫中獲得的克隆，因此GSS 數(shù)據(jù)更能反映所研究生物全基因組的特征。這些多態(tài)性轉(zhuǎn)錄組SSR引物的開發(fā)將為紅豆杉遺傳多樣性的分析、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的挖掘提供更豐富的標(biāo)記。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：鄭京津）