大曲中總酸和氨基酸態(tài)氮的連續(xù)滴定

杜亞飛，蔣英麗，何世興，高 鴻 *，羅愛(ài)民

（1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川省古藺郎酒廠，四川 瀘州 646523）

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，是以淀粉質(zhì)或糖質(zhì)原料，加入糖化發(fā)酵劑，經(jīng)固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的蒸餾酒[1-2]?！扒司浦恰?，在傳統(tǒng)固態(tài)法釀造白酒中，大曲作為釀酒過(guò)程的內(nèi)在動(dòng)力，其品質(zhì)與原酒的出酒率和質(zhì)量密切相關(guān)[3-6]。大曲培菌發(fā)酵期間，微生物利用制曲原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生種類豐富的酶系及代謝產(chǎn)物，這個(gè)過(guò)程是產(chǎn)酸的，故大曲酸度可以從側(cè)面反映出大曲的發(fā)酵情況[7-9]。大曲在白酒釀造過(guò)程中所起的作用主要有發(fā)酵作用、糖化作用和生香作用，而反映曲香物質(zhì)生成強(qiáng)弱的一類指標(biāo)是大曲的生香力[10-11]。由于蛋白質(zhì)在微生物作用下降解生成的氨基酸等物質(zhì)，既作為大曲復(fù)合曲香物質(zhì)重要的前驅(qū)物質(zhì)，又是大曲酒重要的呈香呈味物質(zhì)，通常以氨基態(tài)氮這一指標(biāo)來(lái)反映生香力的強(qiáng)弱[12-13]，同時(shí)氨基酸態(tài)氮也是反映大曲質(zhì)量的一個(gè)重要理化指標(biāo)[14]。因此，大曲酸度和氨基酸態(tài)氮含量的準(zhǔn)確快速測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)大曲的質(zhì)量具有重要意義。

在QB/T4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[15]中，酸度和氨基酸態(tài)氮的測(cè)定是按酸度計(jì)確定終點(diǎn)的中和法分別進(jìn)行測(cè)定。該方法需要分別制備兩個(gè)大曲樣液：測(cè)定酸度的樣液是將10 g當(dāng)量絕干曲浸泡在200 mL蒸餾水中30 min（每隔5 min攪拌一次）后，用濾布過(guò)濾并收集濾液；測(cè)定氨基酸態(tài)氮的樣液是將20 g當(dāng)量絕干曲浸泡在60 mL蒸餾水中30 min（每隔5 min攪拌一次）后，用100 mL容量瓶定容，用濾布過(guò)濾并收集濾液。對(duì)過(guò)濾后得到的2個(gè)樣液再分別用0.1 mol/L和0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。該檢測(cè)方法在樣品較多時(shí)就很繁瑣，為此本研究對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，把原來(lái)測(cè)定酸度和氨基酸態(tài)氮的2個(gè)樣液合并成1個(gè)樣液：將10 g當(dāng)量絕干曲浸泡在100 mL蒸餾水中30 min后（每隔10 min攪拌一次），濾布過(guò)濾，收集濾液，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液先進(jìn)行酸度的滴定，在滴定過(guò)酸度的樣液中直接加入甲醛溶液，繼續(xù)滴定氨基酸態(tài)氮的含量。這樣，不僅節(jié)約了制備樣液的時(shí)間，而且只需配制一種濃度的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，節(jié)省了試劑，具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲：四川郎酒廠；氫氧化鈉、甲醛溶液均為分析純：成都市科龍化工試劑廠。氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mol/L）：按GB/T 601—2002《化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》配制與標(biāo)定；中性甲醛溶液：取適量分析純的甲醛溶液于燒杯中，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 8.2。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型酸度計(jì)：杭州奧力龍儀器有限公司；78-1型磁力攪拌器：金壇市金怡儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原理

制曲過(guò)程中微生物所產(chǎn)的酸如甲酸、乙酸和乳酸等為有機(jī)弱酸，可用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)消耗的氫氧化鈉來(lái)計(jì)算大曲的總酸；在測(cè)定過(guò)酸度的樣液中繼續(xù)加入中性甲醛溶液，根據(jù)氨基酸的兩性作用，甲醛分子與氨基反應(yīng)使其失去堿性，讓羧基呈酸性，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定羧基，根據(jù)加入中性甲醛溶液后消耗的氫氧化鈉來(lái)計(jì)算大曲中氨基酸態(tài)氮的含量。以上滴定均以酸度計(jì)測(cè)定終點(diǎn)。

1.3.2 大曲酸度的測(cè)定

稱取相當(dāng)于10.00 g絕干曲粉碎試樣于250 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪勻后在室溫條件下浸泡30 min后（每隔10 min攪拌一次），用濾布過(guò)濾，棄去初濾液后接澄清濾液備用。

酸度滴定：先對(duì)酸度計(jì)進(jìn)行校正，再根據(jù)濾液溫度進(jìn)行校正定位。先吸取10 mL濾液于250 mL燒杯中，加蒸餾水100 mL搖勻后插入電極，放入一枚磁力轉(zhuǎn)子，開(kāi)啟電磁攪拌器，用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)接近滴定終點(diǎn)時(shí)，放慢滴定速度，每次加半滴氫氧化鈉溶液至pH 8.2即為終點(diǎn)，記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。以水作為空白，用同樣的操作進(jìn)行空白滴定，結(jié)果以10.00 g絕干大曲中含酸的毫摩爾數(shù)表示大曲酸度，大曲酸度計(jì)算公式為：

酸度（mmol/10g）=10×C×（V-V0）

式中：C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V為滴定試樣消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；V0為滴定空白消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL。

1.3.3 大曲氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮滴定：在上述測(cè)定過(guò)酸度的試液中，加入10 mL中性甲醛溶液，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)接近滴定終點(diǎn)時(shí)，每次加半滴氫氧化鈉溶液至pH值為9.2即為終點(diǎn)，準(zhǔn)確記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V1。

空白試驗(yàn)：以蒸餾水作為空白，加入10 mL中性甲醛溶液后重復(fù)上述步驟進(jìn)行操作，消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V2。在測(cè)定一批曲樣時(shí)，空白試驗(yàn)中消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積通常是定值，故測(cè)定時(shí)只需記錄一次V2即可，試樣中氨基酸態(tài)氮含量的計(jì)算公式如下：

氨基酸態(tài)氮含量（mg/100g）=14×C×（V1-V2）×100

式中：C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1為試樣中加入中性甲醛溶液后滴定至終點(diǎn)時(shí)，消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；V2為空白試驗(yàn)滴定至終點(diǎn)時(shí)，消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；14為氮的摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.3.4 國(guó)標(biāo)法和連續(xù)滴定法對(duì)照試驗(yàn)

隨機(jī)選取5個(gè)大曲樣品，制備成樣液，每個(gè)樣液分別采用國(guó)標(biāo)方法和連續(xù)滴定法準(zhǔn)確測(cè)定酸度和氨基酸態(tài)氮含量，每個(gè)樣液進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果取平均值。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

同一樣品在相同條件下，采用連續(xù)滴定法準(zhǔn)確測(cè)定酸度和氨基態(tài)酸氮含量，進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 國(guó)標(biāo)法和連續(xù)滴定法對(duì)比試驗(yàn)

國(guó)標(biāo)法和連續(xù)滴定法測(cè)定大曲酸度和氨基酸態(tài)氮含量的對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 1 Result of comparative experiment

由表1可知，國(guó)標(biāo)法和連續(xù)滴定法測(cè)定同一樣品的酸度完全一致，2種方法測(cè)得氨基酸態(tài)氮含量不存在顯著性差異，屬于偶然誤差，說(shuō)明連續(xù)滴定法和國(guó)標(biāo)法測(cè)得的結(jié)果同等準(zhǔn)確可靠。

2.2 精密度試驗(yàn)

連續(xù)滴定法測(cè)定酸度和氨基酸態(tài)氮含量的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision experiment

由表2可知，采用連續(xù)滴定法測(cè)得酸度的標(biāo)準(zhǔn)差為0.04 mmol/10g，測(cè)得氨基酸態(tài)氮含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03 mg/100g，說(shuō)明采用連續(xù)滴定法測(cè)定大曲酸度和氨基酸態(tài)氮含量的精密度和重復(fù)性高。

3 結(jié)論

國(guó)標(biāo)法和連續(xù)滴定法測(cè)定大曲中氨基酸態(tài)氮含量，原理都是在中性條件下利用氨基酸的兩性作用，令甲醛分子與氨基反應(yīng)，使其失去堿性，從而讓羧基暴露，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定羧基，根據(jù)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液就可計(jì)算出氨基酸態(tài)氮的含量，而測(cè)定大曲的酸度實(shí)質(zhì)上就是中和大曲樣液中總酸的過(guò)程，故可將兩個(gè)測(cè)定項(xiàng)目合并為一個(gè)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與國(guó)標(biāo)法相比，連續(xù)滴定法測(cè)定大曲酸度和氨基酸態(tài)氮含量只需制備一個(gè)樣液和一種濃度的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，操作更簡(jiǎn)便，縮短分析時(shí)間，節(jié)省了試劑，并且可以達(dá)到相同準(zhǔn)確度。

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