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    野生蘋(píng)果酒產(chǎn)香酵母的分離及篩選

    2014-04-24 13:24:14趙海霞華惠敏吳桂君
    中國(guó)釀造 2014年6期
    關(guān)鍵詞:蘋(píng)果酒果酒酒精度

    趙海霞,華惠敏,吳桂君

    (銀川能源學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,寧夏 永寧 750105)

    近年來(lái),蘋(píng)果酒因含有蘋(píng)果與生物發(fā)酵所產(chǎn)生的雙重營(yíng)養(yǎng)成分,具有抗衰老、軟化血管降血脂及美容養(yǎng)顏等保健作用[1]而受到越來(lái)越多的消費(fèi)者青睞。目前,我國(guó)生產(chǎn)蘋(píng)果酒使用的酵母多為葡萄酒等其他果酒專(zhuān)用釀酒酵母,而缺少蘋(píng)果酒專(zhuān)用發(fā)酵菌種,而優(yōu)良蘋(píng)果酒的發(fā)酵不是僅由單一酵母完成的,單一酵母往往會(huì)造成產(chǎn)品風(fēng)味上的缺陷,口味較平淡[2]。所以人們?cè)噲D利用具有增加蘋(píng)果酒香氣風(fēng)味的非酵母屬酵母和具有高發(fā)酵效率的酵母屬酵母進(jìn)行混合發(fā)酵釀造蘋(píng)果酒,既增加蘋(píng)果酒中的酯香物質(zhì)含量,同時(shí)又保證了用于蘋(píng)果酒發(fā)酵的酵母具有較高的發(fā)酵效率。果酒發(fā)酵中賦予酒香的酵母被稱(chēng)為產(chǎn)香酵母,如孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、克勒克酵母屬(Klaeckera)、假絲酵母屬(Candida)和畢赤酵母屬(Pichia)等[3]。它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生一些高級(jí)醇、低級(jí)脂肪酸和酯類(lèi)等芳香物質(zhì),使得果酒氣味芬芳,果香濃郁[4]。

    因此,本文針對(duì)蘋(píng)果酒釀造中所需菌種缺乏的現(xiàn)狀,通過(guò)測(cè)定從自然界分離的4株產(chǎn)香酵母對(duì)160 mg/L的SO2和10%vol酒精度的耐受性后,與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵試驗(yàn),選出J-4號(hào)菌更適合作為蘋(píng)果酒釀造的產(chǎn)香酵母。其發(fā)酵所得蘋(píng)果酒品質(zhì)優(yōu),且酒的香味濃郁,風(fēng)味飽滿,酒體醇厚,具有蘋(píng)果酒的典型風(fēng)味,適用于果酒生產(chǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    土壤:采自寧夏銀川市永寧縣小任果業(yè)蘋(píng)果園中;紅富士蘋(píng)果:購(gòu)自永寧縣小任果業(yè)。

    “安琪”果酒用高活性干酵母:湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn);N號(hào)釀酒酵母:北方民族大學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

    酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)固體培養(yǎng)基:葡萄糖2%,酵母膏1%,蛋白胨2%,瓊脂2%。

    YEPD液體培養(yǎng)基:葡萄糖2%,酵母膏1%,蛋白胨2%。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:寧夏紅富士清洗、破碎、榨汁,用白砂糖調(diào)整果汁糖度,使含糖量為216g/L,用酒石酸、碳酸鈣調(diào)整果汁的酸度,使酸含量為(以酒石酸計(jì))6 g/L,添加H2SO3(按6%添加量),使SO2含量為80 mg/L,采用巴氏消毒法滅菌,65℃30 min。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SW-CJ-IF超凈工作臺(tái):蘇中凈化設(shè)備有限公司;(LED)XSP-10C顯微鏡:上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司;756MC型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì):上海舒耀儀器設(shè)備有限公司;SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱:上海鴻都電子科技有限公司;LDZX-50KBS立式蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;HR-200電子分析天平:日本A&D 公司;DELTA320 pH計(jì):梅特勒-托利多儀器有限公司;微量可調(diào)式移液槍?zhuān)篏ilson;BCD-219D冰箱:青島海爾股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 酵母菌的分離

    無(wú)菌稱(chēng)取10 g土壤放入盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中,振蕩均勻,制成菌懸液,以10-3、10-4、10-5及10-6為濃度梯度,每皿接種量200 μL的接種量,每濃度3個(gè)平行進(jìn)行YEPD固體涂布分離酵母菌。

    1.3.2 產(chǎn)香酵母的篩選

    產(chǎn)香酵母的初篩:將分離出來(lái)的酵母菌株,接種YEPD液體培養(yǎng)基活化后接種到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察,篩選出能產(chǎn)氣味的菌株。

    傳代培養(yǎng):篩選的野生酵母一般性能不穩(wěn)定,為了保證后續(xù)試驗(yàn)的順利進(jìn)行,將已經(jīng)純化的產(chǎn)香酵母進(jìn)行傳代培養(yǎng)5~6次,將性能穩(wěn)定優(yōu)良的菌種進(jìn)行YEPD培養(yǎng)基斜面保存。

    1.3.3 產(chǎn)香酵母的性能測(cè)定[5]

    對(duì)初次篩選的產(chǎn)香酵母進(jìn)行耐SO2及耐酒精性進(jìn)行測(cè)定。

    (一)耐酒精能力的測(cè)定

    配置YEPD液體培養(yǎng)基使酒精度分別為8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol;將各梯度培養(yǎng)液分別分裝,每支試管裝液量10 mL,每個(gè)菌種做3個(gè)平行,每管中接入菌懸液0.5 mL,菌懸液濃度為107個(gè)/mL。以安琪牌果酒釀酒酵母為對(duì)照,32 ℃,180 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)24 h后600 nm處測(cè)定吸光度值,用比濁法測(cè)定菌體生長(zhǎng)量以確定酵母菌的耐酒精能力并進(jìn)行美蘭染色鏡檢。

    (二)耐SO2性能的測(cè)定

    分別配置SO2含量為100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液體培養(yǎng)。分別分裝,每支試管裝液量10 mL,每個(gè)菌種做3個(gè)平行,以安琪牌果酒釀酒酵母為對(duì)照,32 ℃,180 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)24 h后600 nm處測(cè)吸光度值,用比濁法測(cè)定菌體生長(zhǎng)量以確定酵母菌耐SO2的性能。

    1.3.4 產(chǎn)香酵母的復(fù)篩

    將初篩出的各產(chǎn)香酵母與N號(hào)菌按1∶1混合,同時(shí),以“安琪”果酒專(zhuān)用高活性干酵母為對(duì)照K,分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量為250 mg/L,室溫發(fā)酵,測(cè)定其還原糖、滴定酸的變化,當(dāng)其還原糖含量<5 g/L時(shí),用蒸餾比重法測(cè)其酒精度,并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定,主要是評(píng)定各菌種在有酒精產(chǎn)生的環(huán)境中,芳香物質(zhì)的產(chǎn)生情況,篩選出適合蘋(píng)果酒釀造的產(chǎn)香能力強(qiáng)的菌種。

    1.3.5 酵母的分子鑒定

    取0.2 g左右研磨好的樣品,采用KI法[6]提取基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    ITS擴(kuò)增及檢測(cè):參照ITS通用引物序列[7]及GenBank中登錄的Cortinarius屬rDNA ITS序列,設(shè)計(jì)引物對(duì)序列為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),由TaKaRa公司進(jìn)行合成。

    50 μL擴(kuò)增體系:10×PCR Buffer(含Mg2+)5 μL,dNTP 2.5 μL,引物各1 μL,模板0.5 μL,TaqDNA聚合酶1 μL,ddH2O 39 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后,加6×上樣緩沖液混勻,于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    1.3.6 測(cè)定方法

    還原糖測(cè)定方法[8]:斐林試劑法。

    酸的測(cè)定方法[8]:酸堿中和滴定法。

    酒精度測(cè)定方法[8]:蒸餾比重法。

    果酒感官評(píng)定[9]:依據(jù)GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中果酒感官評(píng)定表對(duì)其進(jìn)行打分。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 產(chǎn)香酵母初篩結(jié)果

    根據(jù)菌落形態(tài)、顯微觀察以及平皿的香味評(píng)定初次篩選出5株形態(tài)、香味各異的酵母菌。

    表1 5株酵母菌菌落特征與菌體形態(tài)Table 1 Colony morphology and mycelial morphology of 5 strains

    從表1看出J-3在固體平板上培養(yǎng),散發(fā)出異臭味被淘汰,其他菌用斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 產(chǎn)香酵母的性能測(cè)定結(jié)果

    (1)產(chǎn)香酵母對(duì)酒精耐受力的測(cè)定結(jié)果:

    在一定濃度范圍內(nèi),菌懸液中細(xì)胞濃度與液體光密度成正比,與透光度成反比,通過(guò)比濁法測(cè)培養(yǎng)24 h后菌的濃度來(lái)反應(yīng)各菌在不同濃度酒精培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。由圖1看出,產(chǎn)香酵母在含10%vol酒精的液體培養(yǎng)基中,4株菌的OD值均>0.10,4株產(chǎn)香酵母在此酒精濃度中菌體生長(zhǎng)良好,為了更好的確定4株菌的形態(tài)和出芽情況,進(jìn)行了美藍(lán)染色的酵母菌死活細(xì)胞鑒定,鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,4株菌出芽情況好且活細(xì)胞多。產(chǎn)香酵母的耐酒精能力到10%vol,而果酒的酒精度一般<10%vol,故而4株菌均適用于蘋(píng)果酒的釀造。在其他濃度14%vol~16%vol中OD值的波動(dòng)較大,甚至出現(xiàn)OD值<0.10的情況,菌體的長(zhǎng)勢(shì)參差不齊。在蘋(píng)果酒發(fā)酵過(guò)程中,酵母代謝的主要產(chǎn)物是乙醇,酒精度過(guò)高會(huì)對(duì)產(chǎn)香酵母的新陳代謝產(chǎn)生抑制作用[10],因此具有酒精抗性的產(chǎn)香酵母有利于蘋(píng)果酒混合發(fā)酵的順利進(jìn)行。

    圖1 產(chǎn)香酵母對(duì)酒精耐受力的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Ethanol tolerance of aroma-producing yeast

    圖2 4株菌在10 %vol酒精液體培養(yǎng)基中美藍(lán)染色結(jié)果Fig.2 Dyeing results of 4 strains cultured in 10 %vol alcohol liquid medium with methylene blue

    (2)產(chǎn)香酵母對(duì)SO2的耐受性的測(cè)定結(jié)果:

    從圖3中看出,4株產(chǎn)香酵母分別在SO2含量為100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液體培養(yǎng)基中測(cè)得OD值均0.25,且都耐受160 mg/L SO2,其中J-1和J-2在4個(gè)含SO2濃度梯度的培養(yǎng)基中測(cè)得的OD值在0.3左右,菌體生長(zhǎng)慢,J-4和J-5 在4個(gè)含SO2濃度梯度的培養(yǎng)基中測(cè)得的OD值在0.65左右,菌體生長(zhǎng)快。SO2具有光譜抗菌活性,在果酒釀造中主要起殺菌的作用。在一定濃度下,SO2可以抑制或殺死酵母細(xì)胞。在蘋(píng)果酒釀造過(guò)程中,對(duì)SO2有較高耐受力的產(chǎn)香酵母更適合作為釀酒菌種,因此J-4和J-5更適合果酒釀造。

    圖3 產(chǎn)香酵母的耐SO2能力Fig.3 SO2resistant capacity of aroma-producing yeast

    2.3 產(chǎn)香酵母復(fù)篩結(jié)果

    2.3.1 發(fā)酵過(guò)程的還原糖變化

    用菲林試劑法測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中還原糖的變化,從圖4可以看出,各個(gè)菌發(fā)酵過(guò)程中還原糖逐漸減少,發(fā)酵過(guò)程順利穩(wěn)定進(jìn)行。J-5菌因在發(fā)酵結(jié)束后糖含量為9.1g/L,與其他菌相比較,還原糖含量較高、發(fā)酵能力較弱而被淘汰。J-1、J-2、J-4菌發(fā)酵結(jié)束后還原糖含量<4 g/L,有較強(qiáng)的發(fā)酵能力,但J-1和J-2耐受SO2的能力較差,所以J-4在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中較其他篩選菌發(fā)酵能力較強(qiáng),更適合作為蘋(píng)果酒的釀造菌。

    圖4 發(fā)酵過(guò)程的還原糖含量變化Fig.4 Reducing sugar changes during fermentation process

    2.3.2 果酒的感官評(píng)定

    從表2中看出,J-1、J-2和N號(hào)釀酒酵母混合發(fā)酵,酒精度低,感官評(píng)定結(jié)果差,香味不佳;J-4、J-5和N號(hào)葡萄酒釀酒酵母混合發(fā)酵,酒精度較前兩者高,感官評(píng)定結(jié)果好,蘋(píng)果香味濃,尤其是J-4號(hào)菌,綜合評(píng)定得分最高,確定出J-4號(hào)菌為蘋(píng)果酒釀造的最佳產(chǎn)香酵母。

    表2 蘋(píng)果酒評(píng)定結(jié)果Table 2 Evaluation result of cider

    2.4 J-4菌分子鑒定結(jié)果

    分子測(cè)序結(jié)果:

    5′-GGGATGGCATCTACTGATTTGAGGTCAACTT GATGATATTAAAAGCAACCCTTTGCCTAAGGTACAT TACCATTTCCCTTGTAAAGTAAAACGAATAAATCCA TAAATACATCACAGCGAGAACAGCGTCTCCAAAGA AGCTAAGTGTTGAATTAAAAAAGACTGAAACAGTC TCCAATTTCAAGCTAACCCTGAGTATCGCCCACAAC CAAAAGTTAATAAATTATCTTTTGAGAAGGAAATG A CGCTCAAACAGGCATGCCCCTGAGAATGCTCAAG GGCGCAATGTGCGTTCAAAAATTCAATGATTCACGA GTATCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTA CGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTG TTGAAAGTTTTAAATTATTT TAAAATTTCCGTTAGG AATTTTGGTTTAGTTTAAAAAATATAATAAAATATA ACTGTTTGTGTTTGTTTTTTGCCTTGAACCTTTCGAT TCAAAGCAGAAAGAATTAAATTAAAGTAAAAAACT CCAATGGGGG-3′。

    根據(jù)測(cè)序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可知:J-4號(hào)菌,其序列與Genebank上Hanseniaspora thailandicaAB501147.1相似度達(dá)到99%,認(rèn)定該菌為孢漢遜酵母屬。本屬的真菌有別于其他酵母菌的主要特征,發(fā)酵力強(qiáng),產(chǎn)酯香良好,可增加釀造產(chǎn)品的風(fēng)味[11]。

    3 結(jié)論

    通過(guò)初篩、復(fù)篩,獲得1株適用于蘋(píng)果酒發(fā)酵用的產(chǎn)香酵母J-4。經(jīng)初步的發(fā)酵試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià),J-4號(hào)菌是適合蘋(píng)果酒釀造的產(chǎn)香酵母。分子測(cè)序結(jié)果顯示,該菌屬于孢漢遜酵母屬。對(duì)菌株J-4進(jìn)行蘋(píng)果酒發(fā)酵的工藝條件,如釀酒酵母的添加量及兩者最佳比例、糖濃度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵速度、降糖能力、產(chǎn)酒精能力及溫度等一系列的研究將在后續(xù)試驗(yàn)中繼續(xù)進(jìn)行,從而為完善我國(guó)蘋(píng)果酒釀造工藝及釀造菌種提供依據(jù)。

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