雞致病性大腸桿菌qseC基因缺失突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

元雪湞，劉淑莉，李新生，張素梅，商艷紅，胡功政，杜向黨

雞大腸桿菌病是引起養(yǎng)雞業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一，臨床主要表現(xiàn)為雞急性敗血癥，氣囊炎，肝周炎，心包炎，卵黃性腹膜炎，腫頭綜合征，輸卵管炎等[1-2]。不同日齡的雞均可感染，其發(fā)病率高、死亡率高，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

雞大腸桿菌病的病原為雞致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichiacoli, APEC)，APEC在發(fā)揮致病性過程中，首先粘附于雞粘膜上皮細(xì)胞表面，在此過程中APEC I型菌毛粘附素發(fā)揮重要作用。I型菌毛粘附素是APEC的重要致病因子，95%以上的APEC均可表達(dá)I型菌毛，通過與雞氣管粘膜上皮細(xì)胞表面的甘露糖受體特異性結(jié)合，使APEC粘附在上皮細(xì)胞上，不易被機(jī)體清除，在APEC侵染雞體發(fā)揮致病性過程中起關(guān)鍵作用。I型菌毛的合成和表達(dá)需要多種基因的共同參與，主要包括fimA、fimG、fimH、fimF、fimB、fimE、fimC、fimD和fimI[3]。其中，fimA、fimG、fimH和fimF編碼I型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞蛋白FimA和次要亞蛋白FimG，F(xiàn)imH和FimF。fimH是I型菌毛和甘露糖受體蛋白結(jié)合的粘附素；fimB和fimE編碼的FimB和FimE共同調(diào)控FimA表達(dá)的相變開關(guān)；fimC和fimD編碼的FimC和FimD蛋白與菌毛的生物合成以及在菌體上的定位密切相關(guān)[4]。

近年來，在腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)中發(fā)現(xiàn)QseBC雙組份調(diào)控系統(tǒng)，參與大腸桿菌的毒力調(diào)控。由qseC基因編碼的信號受體蛋白QseC感應(yīng)環(huán)境中的信號分子自誘導(dǎo)物(Autoinducer-3, AI-3) /腎上腺素(Epinephrine, Epi)/去甲腎上腺素(Norepinephrine, NE)，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子QseB調(diào)控細(xì)菌毒力基因的表達(dá)，在細(xì)菌致病過程中扮演著重要角色[5-6]。然而，QseBC雙組份調(diào)控系統(tǒng)是否參與APEC毒力因子的調(diào)控目前還未見報道。因此，本研究擬構(gòu)建雞致病性大腸桿菌qseC基因缺失突變株(WTΔqseC)及其互補(bǔ)株(WTΔqseC：pBADqseC)，并通過測定WTΔqseC和WTΔqseC：pBADqseC的生長、粘附能力和致病因子I型菌毛粘附素相關(guān)基因表達(dá)量的變化來探討qseC基因缺失對其生物學(xué)特性的影響。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒及引物 本試驗所用的菌株、質(zhì)粒和引物分別見表1和表2，引物由上海生工生物工程公司和大連寶生物公司合成。

表1 本試驗所用菌株和質(zhì)粒

1.1.2主要試劑和儀器 Taq酶、dNTP、T4連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶、Primestar高保真酶均購自大連TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Southern雜交試劑盒購自德國Roche公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；熒光定量試劑盒購自美國Promega公司；2720型PCR儀，美國ABI公司；UV-2000紫外分析儀，天能科技(上海)有限公司；電穿孔儀購自Biorad公司；熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司。

1.2WTΔqseC的構(gòu)建與鑒定

1.2.1構(gòu)建重組敲除質(zhì)粒pT-zeocin-qseC分別以細(xì)菌基因組和pGAPZαA質(zhì)粒為模板，以qseC-F/qseC-R和zeocin-F∕zeocin-R為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物分別和pGEM-TREasy Vector連接，在DNA限制性內(nèi)切酶和T4連接酶的作用下得到pT-zeocin-qseC重組質(zhì)粒。

表2 本試驗中所用的引物

1.2.2WTΔqseC的篩選與鑒定 酶切pT-zeocin-qseC重組質(zhì)粒得到qseC上-zeocin-qseC下片段，制備WT感受態(tài)。將qseC上-zeocin-qseC下片段電轉(zhuǎn)化入WT感受態(tài)中，在50 mg/L博來霉素LB瓊脂平板中37 ℃培養(yǎng)，初步篩選。進(jìn)一步用zeocin2-F/zeocin2-R引物進(jìn)行PCR，并測序確證突變菌株WTΔqseC。

進(jìn)一步鑒定突變株，分別提取WT和WTΔqseC的基因組DNA，以zeocin基因的PCR產(chǎn)物作陽性對照，進(jìn)行Southern blot雜交分析。以地高辛標(biāo)記的zeocin抗性基因為探針，將各基因組DNA經(jīng)EcoRI酶切過夜，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離各片段，轉(zhuǎn)膜，80 ℃烘烤2 h固定。預(yù)雜交、洗膜及顯影均嚴(yán)格按照說明書上操作步驟進(jìn)行。

1.3WTΔqseC：pBADqseC的構(gòu)建與鑒定

1.3.1構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIC-qseC以野生菌基因組為模板，mq-qseC-F/mq-qseC-R為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物和pBAD/gIIIC連接，在DNA限制性內(nèi)切酶和T4連接酶的作用下得到pBAD/gIIIC-qseC重組表達(dá)載體。進(jìn)一步用PCR、酶切和測序確證重組表達(dá)載體pBAD/gIIIC-qseC。

1.3.2WTΔqseC：pBADqseC的篩選與鑒定 制備WTΔqseC感受態(tài)，將pBAD/gIIIC-qseC重組載體電轉(zhuǎn)化入WTΔqseC感受態(tài)，用耐藥平板初步篩選。進(jìn)一步用mq-qseC-F/mq-qseC-R引物進(jìn)行PCR，并且提取轉(zhuǎn)化菌總蛋白，跑SDS凝膠電泳，使用考馬斯亮藍(lán)染色，以確證互補(bǔ)菌株WTΔqseC：pBADqseC。

1.4生物學(xué)特性

1.4.1體外試驗 取相同數(shù)量的WT、WTΔqseC和WTΔqseC：pBADqseC分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至三者的OD600值均為0.5，各取0.5 mL加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每間隔0.5 h測取OD600值，重復(fù)試驗3次，取平均值，并繪制生長曲線。

為測定qseC對大腸桿菌生長能力的影響，進(jìn)行體外競爭實驗。細(xì)菌培養(yǎng)同1.4.1，分別將WT與WTΔqseC, WT與WTΔqseC：pBADqseC以1∶1的比例混勻，接種于LB肉湯37 ℃靜置培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)完成后，經(jīng)105稀釋，分別用有zeocin抗性的和無抗性的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果，按照參考文獻(xiàn)計算競爭指數(shù)(Competition index, CI)值[7]。

1.4.2血凝試驗 本試驗采用豚鼠紅細(xì)胞，按照文獻(xiàn)的方法，進(jìn)行血凝實驗(Hemagglutination, HA)，測定WTΔqseC和WTΔqseC：pBADqseCI型菌毛粘附能力的變化[8]。

1.4.3熒光定量PCR 為了進(jìn)一步驗證WTΔqseC和WTΔqseC：pBADqseCI型菌毛相關(guān)基因表達(dá)量的變化，提取WT、 WTΔqseC和WTΔqseC：pBADqseC的總RNA，測定其濃度和含量，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以I型菌毛相關(guān)基因為模板設(shè)計引物fimA-F/fimA-R,fimD-F/fimD-R,fimF-F/fimF-R,fimH-F/fimH-R 和fimG-F/fimG-R, 以大腸桿菌管家基因gapA為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，細(xì)菌總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1WTΔqseC的構(gòu)建與鑒定

2.1.1重組敲除質(zhì)粒pT-zeocin-qseC的鑒定 pT-zeocin-qseC質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1.8 kb)、pT-qseC質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1.6 kb)及其酶切鑒定分別見圖1和圖2，條帶大小與預(yù)期符合。

圖1qseC上-zeocin-qseC下片段的PCR擴(kuò)增電泳圖(a)和T-qseC質(zhì)粒和T-zeocin-qseC質(zhì)粒的EcoRI酶切鑒定(b)

Fig.1ElectrophoresismapforPCRamplificationofqseCup-zeocin-qseCdownfragment(a)andEcoRIdigestionidentificationofT-qseCplasmidandT-zeocin-qseCplasmid(b)

M: DNA marker; 1, 2: pT-zeocin-qseCplasmid;

3: T-qseCplasmid.

2.1.2WTΔqseC的PCR、Southern雜交及測序鑒定 提取WTΔqseC基因組，以zeocin2-F/zeocin2-R為引物，PCR擴(kuò)增zeocin基因，與預(yù)期大小一致(圖略)，PCR測序正確。

使用地高辛標(biāo)記的zeocin抗性基因作為探針，WTΔqseC顯示陽性，WT顯示陰性，與預(yù)期相符，見圖2。

2.2WTΔqseC：pBADqseC的構(gòu)建與鑒定

2.2.1重組表達(dá)載體pBAD/gIII-qseC的鑒定 重組表達(dá)載體pBAD/gIII-qseC的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖略)及其酶切鑒定見圖3，條帶大小與預(yù)期符合，PCR測序正確。

圖2WT和WTΔqseC基因組酶切圖譜(A)及Southern雜交圖譜(B)

Fig.2GenomeDNAofWTandWTΔqseCdigestedbyEcoRI(A)andSouthernblotusingzeocingeneasprobe(B)

M: DS5000 DNA marker; 1: Positive control;

2: Genome DNA of WTΔqseCdigested byEcoRI;

3: Genome DNA of WT genome DNA byEcoRI.

圖3pBAD/gIII-qseC質(zhì)粒的NcoI和PstI酶切鑒定

Fig.3TheelectrophoresismapforNcoIandPstIdigestionidentificationofpBAD/gIII-qseCplasmid

M: DS5000 DNA marker; 1: pBAD/gIII-qseC;

2: pBAD/gIII-qseCdigested byNcoI andPstI.

2.2.2WTΔqseC：pBADqseC的篩選與鑒定 提取WTΔqseC：pBADqseC質(zhì)粒，用mq-qseC-F/mq-qseC-R為引物進(jìn)行PCR，條帶與預(yù)期相符合(圖略)；制備WTΔqseC：pBADqseC蛋白樣品，跑電泳，條帶與預(yù)期相符合。

2.3生物學(xué)特性

2.3.1體外生長試驗 WT、WTΔqseC和WTΔqseC：pBADqseC的生長曲線見圖4，突變株WTΔqseC在各個時間段的平均OD600值相對于野生株WT均較低，說明WTΔqseC生長相對緩慢，互補(bǔ)株WTΔqseC：pBADqseC的生長曲線介于兩者之間，說明WTΔqseC：pBADqseC的生長速度有所提高。

體外競爭試驗獲得CI1=0.67，說明 WTΔqseC在體外的生長能力被輕度致弱，CI2=1.14，說明WTΔqseC：pBADqseC在體外的生長能力恢復(fù)至野生株水平。

圖4WTΔqseC、WTΔqseC：pBADqseC和WT的生長曲線

Fig.4GrowthcurvesofWTΔqseC,WTΔqseC:pBADqseCandWT

2.3.2血凝試驗 HA試驗中，WT、WTΔqseC和WTΔqseC：pBADqseC的平均滴度分別為1.6、0.8和1.66，統(tǒng)計分析顯示W(wǎng)T和WTΔqseC差異顯著(P<0.05)，WT和WTΔqseC：pBADqseC差異不顯著(P>0.05)。說明WTΔqseCI型菌毛粘附能力下降, WTΔqseC：pBADqseC的粘附能力恢復(fù)。

2.3.3熒光定量PCR 本試驗提取WT 總RNA 的A260/A280為2.02，濃度為129.4 ng/μL；提取WTΔqseC總RNA的A260/A280為1.86，濃度為127.5 ng/μL；提取WTΔqseC：pBADqseC總RNA的A260/A280為2.1，濃度為552.2 ng/μL。熒光定量PCR結(jié)果見圖5(圖中為ΔΔCt值的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。通過組內(nèi)重復(fù)可以得出，每個組內(nèi)的Ct值具有很高的可重復(fù)性，說明試驗結(jié)果準(zhǔn)確可信；熔解曲線表明熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度穩(wěn)定，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物設(shè)計合理，沒有非特異性產(chǎn)物，試驗結(jié)果準(zhǔn)確。

圖5I型菌毛相關(guān)基因相對表達(dá)量變化

Fig.5RelativefoldchangeoffimD,fimG,fimF,fimH,andfimAinWTΔqseCandWTΔqseC:pBADqseCcomparedwithWT

3 討 論

近年來，雞大腸桿菌病已經(jīng)上升為養(yǎng)雞業(yè)中最主要的一種細(xì)菌性疾病之一。其血清型眾多、耐藥狀況復(fù)雜，給其防控帶來了巨大困難和挑戰(zhàn)。

病原菌雙組份調(diào)控系統(tǒng)參與眾多病原菌的毒力調(diào)控。因此，深入認(rèn)識病原菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)可為病原菌的致病性干擾提供新型思路與策略[9]。QseBC雙組份調(diào)控系統(tǒng)目前已發(fā)現(xiàn)廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、愛德華氏菌等)中，其與病原菌的致病性調(diào)控密切相關(guān)[5,10-11]。

在腸出血性大腸桿菌EHEC中，QseC可感應(yīng) AI-3、Epi和NE信號分子[6,12]，發(fā)生自磷酸化，隨后將QseB磷酸化，磷酸化的QseB同鞭毛調(diào)節(jié)器flhDC基因啟動子結(jié)合，通過調(diào)控鞭毛調(diào)節(jié)器FlhDC的表達(dá)，調(diào)控鞭毛生物合成，增加菌群運(yùn)動力，從而增加細(xì)菌對宿主的感染能力。此外，QseC還可通過對KdpE和QseF兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子磷酸化作用以及qseEF基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，間接調(diào)控腸細(xì)胞擦抹基因座(LEE)內(nèi)編碼的ler基因、編碼III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的espFu基因和LEE基因座的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控粘附抹平損傷(Attaching and effacing, AE)的形成和志賀毒素的產(chǎn)生。研究表明，在qseC基因缺失突變株中，不能激活上述毒力基因表達(dá)。在兔感染模型中，qseC基因缺失突變株的感染能力顯著下降[13,16]。

尿道大腸桿菌(UropathogenicEscherichiacoli, UPEC)是引起尿道感染的主要病原菌，通過定植和侵襲膀胱細(xì)胞感染宿主。依靠I型菌毛粘附素定植于宿主膀胱細(xì)胞上皮，以胞內(nèi)細(xì)菌群落(intracellular bacterial communities，IBCs)實現(xiàn)對宿主的感染。在UPEC中，QseC通過對QseB的磷酸化作用調(diào)控UPEC毒力相關(guān)基因的表達(dá)；當(dāng)qseC基因缺失時，非QseC途徑磷酸化的QseB，抑制包括鞭毛相關(guān)基因、I型菌毛相關(guān)基因、卷曲菌毛相關(guān)基因和S菌毛相關(guān)基因等在內(nèi)的毒力相關(guān)基因表達(dá)，使細(xì)菌毒力減弱。試驗表明，qseC基因缺失UPEC 的IBC形成量減少，感染小鼠能力減弱[6,17]。

為了研究QseC對雞致病性大腸桿菌毒力的調(diào)控作用，我們成功地構(gòu)建了雞致病性大腸桿菌qseC基因缺失突變株。試驗表明，qseC基因缺失會引起雞致病性大腸桿菌生長能力減弱，粘附能力下降，I型菌毛相關(guān)基因表達(dá)量下降。這些初步研究為雞大腸桿菌病的防控提供了重要的思路。

鑒于以QseC為靶標(biāo)的小分子化合物已取得了積極的進(jìn)展[9]，我們期待QseBC雙組份調(diào)控系統(tǒng)在眾多病原毒力調(diào)控中發(fā)揮的作用得到越來越清楚的闡明。

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