肉雞源彎曲菌的分離、多重PCR鑒定及其耐藥性分析

朱冬梅，劉書亮,2，彭 珍，賴海梅，韓新鋒,2

彎曲菌，尤其是空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)和結腸彎曲菌(Campylobactercoli)是引起人類急性細菌性胃腸炎最常見的原因之一[1]，主要導致人急性胃腸炎，并可能進一步引發(fā)格林-巴利綜合征(Guillain-Barré)、急性神經(jīng)肌肉癱瘓及反應性關節(jié)炎等疾病。其廣泛分布在各種溫血動物體內(nèi)，其中以家禽、家畜和野禽的帶菌量最多，人主要通過食用被其污染的食物及其制品和水源患病，其感染率已經(jīng)超過了沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌O157∶H7[2]，對公共衛(wèi)生安全構成嚴重威脅。由于彎曲菌的培養(yǎng)條件苛刻、生化鑒定方法操作繁瑣、耗時長，因此建立彎曲菌準確、快速的檢測方法尤為重要。近年來，PCR方法因其快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點廣泛應用于細菌鑒定中，尤其是多重PCR技術在食源性致病菌的檢驗和鑒定上已得到較好應用[3]。

隨著抗菌藥在食品動物養(yǎng)殖過程中的大量使用，彎曲菌的耐藥性逐漸增強[4]，且其耐藥性可通過食物鏈傳播到人群[5-6]，對彎曲菌感染的治療難度加大。目前，國內(nèi)外主要針對空腸彎曲菌的耐藥性做了較多研究，很少同時針對空腸、結腸彎曲菌及其他彎曲菌的耐藥性進行分析，尤其在肉雞屠宰過程中，彎曲菌的污染和耐藥性方面尚少見報道。

因此，本研究旨在分析肉雞屠宰加工過程中彎曲菌的污染及其耐藥性情況，為彎曲菌的分離鑒定提供方法參考，同時，為肉雞屠宰加工企業(yè)和相關機構防制彎曲菌污染及其耐藥性安全評價提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品 在四川某肉雞屠宰加工廠，用無菌剪刀剪取雞盲腸2～4 cm，置于保鮮袋中；用無菌棉簽擦拭凈膛后肉雞胴體表面、分割后雞肉表面，并置于5 mL増菌液中；所有樣品置于低溫冰盒中4 h內(nèi)運回實驗室。該屠宰場的肉雞均為該企業(yè)自育的優(yōu)質(zhì)白羽肉雞，采用網(wǎng)上養(yǎng)殖的方式，飼養(yǎng)日齡35-42 d出欄后，送屠宰場統(tǒng)一屠宰。

1.1.2菌株 空腸彎曲菌(Campylobcrterjejuni)ATCC33560、結腸彎曲菌(Campylobcrtercoli)ATCC33559、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC29213由課題組提供。

1.1.3培養(yǎng)基 改良Skirrow氏瓊脂基礎、CCDA瓊脂基礎、Bolton肉湯、布氏肉湯、哥倫比亞血瓊脂基礎、M-H培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物技術有限公司；標準新生級牛血清、脫纖維羊血購自成都微克生物技術有限公司。

1.1.4主要試劑 過氧化氫、四甲基對苯二胺鹽酸鹽為國產(chǎn)分析純試劑；Bio West瓊脂糖購自成都微克生物技術有限公司；DL 2000 DNA Marker、2× long Taq PCR MasterMix、GoldviewTM核酸染料均購自北京天根生化有限公司；其余試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.5抗生素 氨基糖苷類：慶大霉素(gentamicin, GEN)、鏈霉素(streptomycin, STR)；四環(huán)素類：四環(huán)素(tetracycline, TET)；氯霉素類：氟苯尼考(florfenicol, FLO)；喹諾酮類：環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)；左氧氟沙星(levofloxacin，LEV)；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(erythromycin，EM)；林可胺類：克林霉素(clindamycin，CLI)。以上藥物均為原粉，由課題組提供。頭孢哌酮、萬古霉素、三甲氧芐氨嘧啶乳酸鹽、多粘菌素B均購自成都奧克生物技術有限公司。

1.1.6主要儀器 BSC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇州安泰空氣技術有限公司)；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；3111二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)；SORVALL離心機(美國科俊儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；C1000 Thermal Cycler PCR儀(Bio-RAD)；PowerPac Basic電泳儀(Bio-RAD)；水平電泳槽(Bio-RAD)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD)等。

1.2方法

1.2.1菌株的分離 用棉簽蘸取少許糞樣，劃線于Skirrow血平板上，42 ℃微需氧條件(5% O2、10% CO2、85% N2)下培養(yǎng)48 h；取0.5 mL樣品増菌液加入含5%脫纖維綿羊血的9.5 mL新鮮増菌液中，42℃微需氧増菌48 h后，劃線Skirrow血平板；挑取符合彎曲菌典型形態(tài)的菌落劃線于CCDA平板上，培養(yǎng)48 h后，在平板上挑取灰色、扁平、像水珠的菌落劃線于哥倫比亞血平板上進行純化培養(yǎng)。

1.2.2菌株的生化初步鑒定 對分離菌株進行革蘭氏鏡檢，并按照GB/T 4789.9-2008方法對分離菌株進行氧化酶實驗和過氧化氫酶實驗。

1.2.3菌株的三重PCR鑒定

1.2.3.1PCR引物設計 參考Denis M等[7]的報道，針對彎曲菌屬16SrRNA基因的引物(16S-F和16S-R)和結腸彎曲桿菌CeuE基因的引物(CeuE-F和CeuE-R)合成2對引物；根據(jù)GenBank公布的空腸彎曲桿菌HipO基因序列，設計一對引物(HipO-F和HipO-R)，由(大連)寶生物公司合成。

表1 靶基因名稱、引物序列及擴增產(chǎn)物大小

1.2.3.2PCR模板的制備 將純化培養(yǎng)后的菌種接種于布氏肉湯中，42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，采用ISABEL M[8]等的方法提取細菌的DNA。

1.2.3.3PCR擴增 根據(jù)預試驗結果，設置三對引物濃度比例為16SrRNA:HipO:CeuE=4∶2∶1，PCR反應體系為25 μL，其中包括2× long Taq PCR MasterMix 12.5 μL ，模板1 μL，16SrRNA、HipO、CeuE基因上下游引物的終濃度分別為0.8 μmol/L、0.4 μmol/L 、0.2 μmol/L，補雙蒸水至終體積25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃，預變性10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，60 s，35個循環(huán)；72 ℃，延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖(0.5×TBE)凝膠電泳后，觀察并成像。

1.2.3.4三重PCR特異性實驗 取空腸彎曲菌ATCC33560、結腸彎曲菌ATCC33559、大腸桿菌ATCC25922的DNA，同時設計不加模版、只加單側引物兩組對照，進行三重PCR引物特異性試驗。

1.2.3.5擴增產(chǎn)物測序鑒定 對空腸彎曲菌標準菌株ATCC33560及隨機選取的空腸彎曲菌陽性菌株12-JF97的16S rRNA、HipO基因以及結腸彎曲菌標準菌株ATCC33559及隨機選取的空腸彎曲菌陽性菌株13-JF74的CeuE擴增片段進行膠回收后由invitrogen公司克隆測序，并進行序列分析。

1.2.3.6彎曲菌分離率的統(tǒng)計 經(jīng)鑒定為彎曲菌陽性的菌株，采用終濃度20%的甘油，-80℃凍藏。經(jīng)上述分離鑒定出彎曲菌的樣品為陽性樣品，從每一份陽性樣品中獲得并保存一株彎曲菌菌株。分離率計算如下：分離率=(彎曲菌分離陽性樣品數(shù)/樣品總數(shù))×100%。

1.2.4藥敏試驗 采用美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)推薦的瓊脂稀釋法，對彎曲菌分離株進行8種臨床常用抗生素的MIC值測定，以空腸彎曲菌ATCC33560為質(zhì)控菌株，按照CLSI標準[9]和文獻[10-11]進行操作和結果判斷。

表2 彎曲菌的藥敏試驗判定標準

2 結 果

2.1分離純化 在哥倫比亞血培養(yǎng)基上挑取不溶血、扁平、灰色、半透明、有時沿接種線向外擴散生長的菌落，在CCDA培養(yǎng)基上為有光澤、灰白、濕潤的菌落。經(jīng)涂片作革蘭氏染色鏡檢為G—菌，如小逗點狀，兩菌體的末端相連時，呈S形、海鷗形或螺旋狀。

2.2生化初步鑒定 具備以下特征：鏡檢符合彎曲菌形態(tài)、氧化酶試驗陽性、過氧化氫酶試驗陽性、可在血平板上生長而營養(yǎng)瓊脂平板不生長，可初步鑒定為彎曲菌。據(jù)此從651份樣品中，分離純化得到333株彎曲菌疑似菌株。

2.3PCR引物特異性實驗結果 對所設計的三對引物進行特異性驗證，結果如圖1所示，空腸彎曲菌ATCC33560在857 bp和600 bp處，分別獲得預期的兩條條帶，結腸彎曲菌ATCC33559在857 bp和462 bp處，分別獲得預期的兩條條帶，當空腸彎曲菌和結腸彎曲菌DNA混合時，能獲得預期的三條條帶，其余對照均未擴增出片段，說明所設計的兩對引物特異性可靠。

圖1彎曲菌多重PCR特異性驗證電泳圖

Fig.1ElectrophoresisofspecificitytestofmultiplexPCR

M: DL2000 DNA marker; 1:E.coliATCC25922; 2: No template; 3: No primer; 4:Campylobactercoli; 5:Campylobacterjejuni; 6:CampylobactercoliandCampylobacterjejuni.

2.4擴增產(chǎn)物基因序列分析 以空腸彎曲菌ATCC33560、結腸彎曲菌ATCC33559的DNA為模板，擴增的16SrRNA、HipO、CeuE基因PCR產(chǎn)物純化后克隆測序分別得到長約為857 bp、600 bp和462 bp的片段，與設計大小相符，測得序列已在NCBI注冊，登錄號分別為KF541294、KF541296和KF541298；采用BLAST和DNASTAR MegAlign進行基因比對分析，ATCC33560的16SrRNA(KF541294)與彎曲菌登錄號JX912519.1、GQ167678.1、 KC197219.1等的16SrRNA基因序列有97.9%～98.2%的同源性； ATCC33560的HipO(KF541296)基因與空腸彎曲菌登錄號FJ655194.1、FJ654193.1、AY168302.1等的馬尿酸鈉酶相應基因序列有99.0%～99.5%的同源性；ATCC33559的CeuE(KF541298)基因與結腸彎曲菌登錄號FJ946065.1、X88849.1的基因序列均有98.7%～99.3%的同源性，進一步表明該方法正確和特異。

2.5三重PCR鑒定方法應用 采用建立的三重PCR方法，對分離的疑似彎曲菌進行PCR鑒定(圖2)，并隨機挑取菌株號為12-JF97的的16SrRNA和HipO基因以及13-JF74的CeuE基因產(chǎn)物進行序列分析，結果表明，12-JF97的16SrRNA(KF541293)基因序列與本實驗ATCC33560的16SrRNA同源性為99.6%，12-JF97的HipO(KF541295)基因序列與本實驗ATCC33560的HipO同源性為100%，13-JF74的CeuE(KF541297)基因序列與本實驗ATCC33559的CeuE同源性為100%，表明被鑒定的陽性菌株結果正確。利用該方法，從333株疑似彎曲菌中，鑒定出空腸彎曲菌160株、結腸彎曲菌130株，其他彎曲菌11株，彎曲菌總分離率為46.24%，其中空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的分離率分別為24.58%(160/651)、19.97%(130/651)；屠宰前、屠宰過程中及屠宰后彎曲菌的分離率分別為56.10%、31.00%、17.00%，其中空腸彎曲菌在三個環(huán)節(jié)中的分離率分別為34.59%、4.00%、0，結腸彎曲菌在屠宰前、中、后3個環(huán)節(jié)中的分離率分別為19.29%、26.00%、17.00%。

圖2部分疑似彎曲菌三重PCR產(chǎn)物的電泳圖

Fig.2ElectrophoresisoftriplexPCRamplifiedproductsfrompartisolatedCampylobacter

M: DL2000 DNA marker; 1-47: Part of samples

2.6彎曲菌分離菌株的耐藥情況 根據(jù)CLSI(2010)標準，本研究中301株彎曲菌對8種抗生素的耐藥率統(tǒng)計見圖3。彎曲菌分離株對CIP的耐藥率最高(93.02%)，對TET、LEV以及CLI的耐藥率較高，分別為87.71%、87.71%、80.07%，對GEN(67.11%)、EM(49.50%)、STR(31.89%)的耐藥率居中，對FLO(13.29%)的耐藥率較低。本研究還發(fā)現(xiàn)， 空腸彎曲菌和結腸彎曲菌對同一抗生素的耐藥性有所不同，但均對CIP的耐藥率最高，分別為88.13%、100.00%，對FLO的耐藥率均較低，分別為16.25%、8.46%；實驗結果表明，空腸彎曲菌對EM的耐藥性較低，僅為14.38%，結腸彎曲菌對其耐藥性較高，為93.85%，與相關文獻[12]報道相符；總體說來，結腸彎曲菌的耐藥率高于空腸彎曲菌。

圖3肉雞源彎曲菌對不同抗生素的耐藥率

Fig.3DrugresistancerateofchickensourceCampylobacterspp.againstdifferentantimicrobialagents

2.7彎曲菌的多重耐藥性及耐藥譜 肉雞屠宰過程中分離的301株彎曲菌對8種抗生素產(chǎn)生了52種耐藥譜，耐藥譜CIP LEV GEN TET CLI EM優(yōu)勢明顯，占所有菌株的33.89%(102/301)；CIP LEV GEN STR TET CLI EM 和CIP LEV TET CLI均為占8.31%(25/301)；CIP LEV TET I占6.98%(21/301)。屠宰前，雞盲腸中分離的彎曲菌共產(chǎn)生了52種耐藥譜、屠宰環(huán)節(jié)及屠宰后成品雞肉中彎曲菌的耐藥譜分別為8種、2種，從屠宰上游環(huán)節(jié)到下游環(huán)節(jié)，彎曲菌耐藥譜有明顯縮小的趨勢，且其優(yōu)勢耐藥譜均為CIP LEV GEN TET CLI EM，分別占分離株的26.88%(68/253)、64.52%(20/31)、82.35%(14/17)。

本研究結果顯示，彎曲菌分離株對8種抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，多重耐藥(耐受三種及其以上抗生素)率為93.69%(282/301)，耐6種藥物的菌株最多，為42.19%(127/301)，耐3種、4種、7種藥物的菌株較多，分別為12.96%(39/301)、15.28%(46/301)、11.63%(35/301)(圖4)，5重耐藥菌株占所有菌株的9.63%(29/301)，有6株(1.99%)對8種抗生素具有耐藥性。其中空腸彎曲菌和結腸彎曲菌多重耐藥率分別為91.25%(146/160)、99.23%(129/130)，其余彎曲菌的多重耐藥率為63.64%(7/11)；其中，空腸彎曲菌主要集中在3、4、5、6重耐藥，為12.64%、13.95%、7.97%、9.30%，結腸彎曲菌主要集中在6重和7重耐藥，為32.23%、7.97%。

圖4肉雞源彎曲菌的多重耐藥分布情況

Fig.4Multi-antimicrobialresistancedistributionofchickensourceCampylobacterspp.

3 討 論

3.1彎曲菌為微需氧菌，對營養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求比較苛刻，且很容易進入VBNC(Viable but Nonculturable) 狀態(tài)，無法繼續(xù)用常規(guī)培養(yǎng)方法檢測，但這些細胞仍然是“活”的，通過環(huán)境或食物鏈進入動物或人體[13]，對食品安全構成嚴重威脅。因此，在空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的分離過程中，應當注意樣品的保存和運輸，保證其生長所需要的微需氧環(huán)境；且可以通過在選擇性培養(yǎng)基中添加抗生素(如萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B等)，以提高其分離率。

3.2彎曲菌培養(yǎng)周期長、生化鑒定較為繁瑣，且檢測結果常常不典型，特別是空腸彎曲菌和結腸彎曲菌較難通過常規(guī)生化鑒定方法區(qū)別，其差別僅在于是否分解馬脲酸。由于PCR技術特異性強、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點，常用于細菌的鑒定中。HipO(馬脲酸酶基因)基因為空腸彎曲菌(包括空腸亞種和德萊亞種)所特有，陳荀[14]等應用16S rRNA和HipO基因從183份樣品中鑒定了21株空腸彎曲桿菌；Huo-Shu H等[15]針對空腸彎曲菌和結腸彎曲菌ceuE基因，設計兩對引物，建立了檢測了空腸、結腸彎曲菌的二重PCR方法，可以擴增兩條大小不一的特異性片段，能有效的區(qū)分空腸彎曲菌和結腸彎曲菌。因此，本文針對彎曲菌屬的16S rRNA、空腸彎曲菌的HipO和結腸彎曲菌的CeuE基因設計引物，通過三重PCR的方法對空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的鑒定，特異性強，操作較為簡單，檢測時間短，能特異性的鑒定空腸彎曲菌和結腸彎曲菌，進一步表明多重PCR方法可以用于常規(guī)實驗室和臨床彎曲菌的檢測中。

3.3本實驗應用GB/T4789.9-2008中的增菌培養(yǎng)、選擇性平板分離、彎曲菌屬初步鑒定及建立的空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的三重PCR鑒定的檢測方法，從333株彎曲菌疑似菌株中，準確鑒定出301株彎曲菌，其中，空腸彎曲菌160株、結腸彎曲菌130株，其他彎曲菌11株，彎曲菌總分離率為46.24%，空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的占彎曲菌分離株的96.35%，與Debretsion A(77.0%)[16]、Kiseon Han(37.7%)[17]、Kovalenko K(92.5%)[18]等的報道有差異，可能是不同地區(qū)彎曲菌的污染情況不一；娜仁高娃[19]等建立了一套同時檢測空腸和結腸彎曲菌的三重PCR方法，并利用該方法，分析了雞糞中彎曲菌的污染情況，其發(fā)現(xiàn)雞糞中空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的污染率為33.7%，低于本實驗結果，說明該地區(qū)雞糞中彎曲桿菌的污染情況較為嚴重，同時說明本實驗建立的方法能夠有效的提高雞糞中彎曲菌的分離率。

3.4本實驗中空腸、結腸彎曲菌占彎曲菌陽性菌株的96.35%，與文獻報道一致[20]。結腸彎曲菌占彎曲菌陽性菌株的43.19%，高于瞿偉華[21](24.21%)、楊毓環(huán)[22](27.67%)、娜仁高娃(20.31%)等的報道，但與Zhao CW(41.30%)等人的結果相似，說明肉雞屠宰中，彎曲菌污染主要集中在空腸彎曲菌和結腸彎曲菌，應引起重視。實驗結果表明，在肉雞屠宰過程中，屠宰前、屠宰過程中及屠宰后彎曲菌的分離率分別為56.10%、31.00%、17.00%，說明從屠宰上游環(huán)節(jié)到下游環(huán)節(jié)，彎曲菌的污染可能存在傳播趨勢，尚需進一步采用PFGE進行溯源分析。

3.5藥敏試驗結果表明彎曲菌的耐藥情況較嚴重，與國內(nèi)外有關彎曲菌耐藥情況的報道較為相近[23-26]。本實驗結腸彎曲菌分離株對四環(huán)素的耐藥率為99.23%，與Qin SS[23]等的實驗結果(95%)較為一致，但明顯高于許紫建[24]的研究(50.79%)；本實驗彎曲菌分離株對紅霉素的耐藥率(49.50%)，與Luangtongkum T[25](80%)的報道差異較大，但與Sato k[26]的結果(45%)較為一致，可能是菌株來源地區(qū)和來源樣品不同，以及國內(nèi)外對抗菌藥在食品動物中的使用標準不一，導致彎曲菌的耐藥性有所差異。

盡管彎曲菌的流行已引起各國關注，但是由于其爆發(fā)少、致死率低、且其培養(yǎng)條件苛刻，很多國家尚未建立起對彎曲菌的監(jiān)測系統(tǒng)，因此本研究建立了實用的檢測方法，為相關部門分析彎曲菌的流行提供了參考，并為動物性食品源彎曲菌污染的防制提供了基礎數(shù)據(jù)。

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