多房棘球絳蟲EM95蛋白的生物信息學(xué)分析

范彥雷，李 立，婁忠子，閆鴻斌，賈萬忠

泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)，又稱泡型包蟲病，是由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis, Em)的幼蟲引起的一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，可感染包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物，呈世界性分布。目前該病呈現(xiàn)感染地區(qū)以及感染宿主擴(kuò)增的趨勢，在一些非流行區(qū)的國家和地區(qū)也首次出現(xiàn)有感染人的報(bào)道[1]，同時(shí)也有該寄生蟲感染非特異性宿主的報(bào)道，從而間接增加人的感染[2]。在我國的青海、新疆、甘肅、寧夏及四川等地區(qū)，人泡型棘球蚴病又稱“蟲癌”，嚴(yán)重威脅著廣大牧民的生命和健康[3]。然而目前對于泡型棘球蚴病的治療以手術(shù)治療為主，藥物治療為輔，但在術(shù)后易出現(xiàn)疾病的復(fù)發(fā)現(xiàn)象，效果欠佳。其防治主要是給犬定期驅(qū)蟲和宣傳教育為主的綜合防治措施，在偏遠(yuǎn)地區(qū)該防治措施的效果也不甚理想。因此當(dāng)務(wù)之急應(yīng)積極尋找新的有效防治措施來預(yù)防和控制該病的流行和進(jìn)一步蔓延。

免疫預(yù)防是防止各種疾病流行方法中比較有效的措施，泡型棘球蚴病也不例外。目前，多房棘球絳蟲相關(guān)抗原分子主要有EMⅡ/3、EM10、EM14-3-3、EM18、EMY162，然而當(dāng)前研究結(jié)果表明，這些抗原分子的保護(hù)力較低或不具備其堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)力[4-7]。因此需要進(jìn)一步研究新型的多房棘球絳蟲抗原分子作為候選疫苗分子。EG95分子是一種分子量為24.5 ku的天然抗原[8]，在細(xì)粒棘球絳蟲的各個(gè)階段均有表達(dá)，是針對各階段均具有有效保護(hù)作用的疫苗分子[9]。EG95重組抗原、合成肽疫苗、DNA疫苗、重組酵母、重組牛痘病毒疫苗、重組BCG疫苗等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明EG95抗原對細(xì)粒棘球絳蟲感染宿主具有很好的保護(hù)效果，是目前最有效的抗細(xì)粒棘球絳蟲的疫苗分子之一[10]。EM95基因最早由Gauci 克隆和鑒定的，其全長2 34 bp，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其結(jié)構(gòu)與EG95基因相似[11-12]。對其核苷酸和氨基酸序列的進(jìn)一步分析表明，EM95是一種胞外型和分泌型蛋白，是成為疫苗分子的先決有效條件[11]。EM95免疫小鼠后期保護(hù)性可達(dá)到78.5%～82.9%，但低于EG95對綿羊的保護(hù)率[11，13-14]。因此，本文利用生物信息軟件從生物信息學(xué)方面對EM95B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析，并與EG95蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，為制備更為有效的EM95疫苗的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究奠定理論基礎(chǔ)和提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology， NCBI)數(shù)據(jù)庫中檢索EM95蛋白序列，確定要分析的EM95蛋白序列(登錄號：AAL51153)和EG95蛋白序列(登錄號：AAQ93497)。

1.2生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件 利用常見生物信息學(xué)分析網(wǎng)站和本地分析軟件(見表1)對EM95蛋白的二級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域以及B細(xì)胞抗原表位等進(jìn)行綜合分析與預(yù)測，同時(shí)比對了EM95和EG95兩個(gè)蛋白一級序列并分析了差異位點(diǎn)存在的區(qū)域。

2 結(jié) 果

EM95蛋白質(zhì)序列由Gauci等提交，其序列來源于從德國普通小鼠中發(fā)現(xiàn)的原頭節(jié)所提取的mRNA所翻譯的蛋白質(zhì)。由156個(gè)氨基酸殘基組成，屬分泌蛋白，含有一個(gè)糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定點(diǎn)和一個(gè)Fn-3型結(jié)構(gòu)域及N∕C端疏水區(qū)[15]。此外有此結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)還有EG95、To45W、TSOL16、TSOL18等[16]。其中Fn-3型結(jié)構(gòu)域是六鉤蚴與中間宿主免疫內(nèi)分泌間相互作用的重要區(qū)域，在誘導(dǎo)免疫保護(hù)方面起到重要作用。

2.1EM95和EG95氨基酸殘基比對及差異位點(diǎn)分析 利用EBI網(wǎng)站中的ClustalW2軟件對EM95和EG95氨基酸殘基進(jìn)行比對(見圖1)，并統(tǒng)計(jì)差異位點(diǎn)的氨基酸殘基(見表2)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，EM95和EG95蛋白156個(gè)氨基酸殘基中存在31個(gè)突變位點(diǎn)，差異達(dá)22.2%，其中極性氨基酸殘基突變?yōu)榉菢O性的有3個(gè)位點(diǎn)，非極性氨基酸殘基突變?yōu)闃O性的有4個(gè)位點(diǎn)，其余均為極性與極性、非極性與非極性間突變。

表1 常用生物信息學(xué)網(wǎng)站及軟件

圖1利用ClustalW2軟件對EM95和EG95蛋白氨基酸殘基比對

Fig.1AminoacidresiduealignmentofEM95andEG95proteinusingClustalW2

表2 EM95和EG95蛋白氨基酸殘基差異位點(diǎn)分析

注：數(shù)字表示序列比對差異位點(diǎn)；+∕-分別表示氨基酸殘基極性內(nèi)與極性間的變異

Note: Numbers indicated the alignment different position; +∕- represents the amino acid residue divergence of intra- and inter-polarity.

2.2EM95抗原B表位分析

2.2.1EM95抗原蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用EXPASY服務(wù)器中SOPMA在線軟件對EM95二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，EM95蛋白質(zhì)中柔性結(jié)構(gòu)占氨基酸殘基總數(shù)的45.51%，其中無規(guī)卷曲占39.10%，β轉(zhuǎn)角占6.41%；α螺旋和β折疊(extended strand)分別占25.64%和28.85%，各種結(jié)構(gòu)在EM95抗原中分布情況(見圖2)。

2.2.2EM95蛋白跨膜區(qū)預(yù)測 使用TMHMM對EM95蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，TMHMM綜合了跨膜區(qū)疏水性、電荷偏倚、螺旋長度和膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)限制等性質(zhì)，采用隱馬氏模型，對跨膜區(qū)及膜內(nèi)外區(qū)進(jìn)行整體的預(yù)測(見圖3)。從預(yù)測結(jié)果可以看出EM95蛋白存在一個(gè)跨膜區(qū)，其中1～132位氨基酸殘基位于細(xì)胞外，139～155位氨基酸殘基跨膜，156位氨基酸殘基位于細(xì)胞內(nèi)。這與EM95蛋白C端是疏水區(qū)相吻合。

圖2SOPMA分析的EM95二級結(jié)構(gòu)

Fig.2ThesecondarystructureofEM95usingSOPMAanalysis

圖3 EM95蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測

Fig.3ThetransmembranestructurepredictionofEM95protein

2.2.3DNAStar軟件分析EM95蛋白 DNAStar軟件對EM95蛋白的預(yù)測(見圖4)，Kyte-Doolittle方法預(yù)測EM95親水性區(qū)域?yàn)椋?5～37、47～64、69～87、94～101和105～134。Eisenberg方法預(yù)測的兩親性結(jié)果在親水區(qū)域范圍內(nèi)，與Kyte-Doolittle方法相吻合。Karplus-Schulz預(yù)測EM95柔性區(qū)域顯示可塑性較強(qiáng)的區(qū)域?yàn)椋?8～35,41～47,57～64,69～75,78～82,85～88,93～97,108～122,125～138；采用Jameson-Wolf方法預(yù)測EM95蛋白抗原性發(fā)現(xiàn)存在5個(gè)高度的抗原區(qū)，分別位于17～35,57～64,67～89,92～98,105～131。表面區(qū)域通常是良好的抗原，在抗體產(chǎn)生上會(huì)有更好的效果，Emni方法表明，EM95蛋白在17～20,27～34,76～82,109～114,126～131等部位氨基酸殘基存在突出表面區(qū)。綜合以上數(shù)據(jù)可推測出EM95蛋白存在5個(gè)B細(xì)胞抗原表位，分別為:17～35,47～64,69～89,92～98,105～131。

2.2.4在線網(wǎng)站IEBD預(yù)測EM95蛋白抗原B細(xì)胞表位 利用在線網(wǎng)站IEBD預(yù)測EM95蛋白抗原細(xì)胞表位(見圖5)：1)Chou﹠Fasman Beta-Turn Prediction分值較高區(qū)域?yàn)?18～24、28～35、41～49、51～65、68～77、83～90、93～100、108～113、127～129、132～139)；2)對EM95進(jìn)行Emini表面可及性分析，(分值較高區(qū)域：17～20、27～36、69～72、75～83、94～95、107～121、126～130)；3)Karplus﹠Schulzz柔韌性區(qū)域預(yù)測，EM95分值高的區(qū)域?yàn)椋?8～35、42～47、57～64、69～75、78～82、85～88、93～98、108～122、125～139；4)Kolaskar ﹠ Tongaonkar 抗原性指數(shù)預(yù)測，可能存在的表位區(qū)域?yàn)椋?～18、33～48、50～59、65～79、86～94、96～107、137～152；5)Parker的親水性預(yù)測顯示EM95的高親水性區(qū)域?yàn)椋?8～33、45～47、59～65、68～73、75～76、79～89、103～116、118～121、124～139；6)Bepipred抗原表位預(yù)測，EM95存在多個(gè)Bepipred線性抗原表位區(qū)域?yàn)椋?9～21、25～33、59、61、69～77、81～86、107～111、127～134、137～138。綜合以上參數(shù)分析，得出EM95蛋白可能存在7個(gè)潛在B細(xì)胞抗原表位區(qū)域：18～35,41～48,50～65,69～90,93～100,107～121,124～139。

圖4 DNAStar軟件分析EM95蛋白各項(xiàng)參數(shù)

綜合以上兩個(gè)B細(xì)胞抗原表位預(yù)測分析軟件結(jié)果，最終確定EM95抗原B細(xì)胞表位有6個(gè)可能區(qū)域，分別為：17～35、42～64、69～90、92～100、105～121、124～139。

3 討 論

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，計(jì)算機(jī)輔助疫苗設(shè)計(jì)技術(shù)正帶動(dòng)著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)向一個(gè)新領(lǐng)域飛速發(fā)展。目前在線或本地蛋白質(zhì)分析工具為科研工作者分析蛋白質(zhì)序列，尋找蛋白質(zhì)序列中的特殊結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對其進(jìn)行加工和修飾，從而使其獲得免疫原性更強(qiáng)的抗原。自上世紀(jì)80年代Hoop和Woods提出親水性參數(shù)預(yù)測抗原表位方法以來[17]，已有許多參數(shù)、算法發(fā)表，在B細(xì)胞蛋白抗原表位預(yù)測研究中起到了巨大的推動(dòng)作用。Hoop-Woods方案認(rèn)為蛋白質(zhì)氨基酸殘基可分為親水性和疏水性殘基兩類，該方案是以氨基酸殘基由有機(jī)相到水相環(huán)境轉(zhuǎn)移的自由能為依據(jù)來計(jì)算氨基酸的親水性，親水性殘基一般位于蛋白質(zhì)表面，而疏水性殘基則位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，位于蛋白質(zhì)表面的親水性氨基酸殘基易于B細(xì)胞膜上的的受體(BCR)結(jié)合，進(jìn)而刺激B細(xì)胞活化產(chǎn)生抗體。Emini表面可及性分析方案放映了抗原內(nèi)、外兩層氨基酸殘基的分布情況[18]，最早在分析甲型肝炎病毒(HAV)和脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒VP1蛋白表面特征時(shí)，合成一段含有HAV特異性氨基酸序列能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HAV中和抗體的合成肽，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)病毒蛋白質(zhì)間存在結(jié)構(gòu)同源特征[19]。Karplus和Schulzz柔韌性區(qū)域預(yù)測是基于已知結(jié)構(gòu)的31個(gè)蛋白質(zhì)的Cx的溫度β因子，認(rèn)為蛋白質(zhì)抗原多肽鏈骨架具有一定的活動(dòng)性，其活動(dòng)性強(qiáng)的區(qū)域易成為抗原表位來預(yù)測蛋白質(zhì)抗原表位的方法[20]。Kolaskar和Tongaonkar 抗原性指數(shù)預(yù)測方案依據(jù)氨基酸殘基理化特征及在已知表位片段上出現(xiàn)的頻率而發(fā)展起來的預(yù)測蛋白質(zhì)抗原決定簇的方法，其預(yù)測率達(dá)75%[21]；Jameson-Wolf抗原指數(shù)預(yù)測方案則是通過對20個(gè)研究深入的蛋白質(zhì)中的69個(gè)連續(xù)位點(diǎn)上606個(gè)氨基酸殘基統(tǒng)計(jì)分析而建立起來抗原性刻度[22]。Parker親水性指數(shù)預(yù)測依據(jù)20個(gè)合成肽模型保留時(shí)間的高效液相層析參數(shù)，同時(shí)比較了其他9個(gè)相同尺度范圍的參數(shù)，結(jié)果表明，該參數(shù)與抗原性吻合度最好，同時(shí)結(jié)合其他三個(gè)預(yù)測抗原性較好的參數(shù)來提高預(yù)測的準(zhǔn)確度[23]。Bepipred線性抗原表位預(yù)測方案是在最好的預(yù)測線性B細(xì)胞表位的隱馬爾科夫模型的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的抗原表位預(yù)測方法，其預(yù)測效果較其他方法都佳[24]。此外，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方案認(rèn)為β轉(zhuǎn)角多為位于蛋白質(zhì)抗原表面的凸出結(jié)構(gòu)，易與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，而α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)則不易與抗體嵌合，因此β轉(zhuǎn)角區(qū)域可能為抗原表位[25]。由于各個(gè)分析軟件依據(jù)的參數(shù)及模型不一樣，因此只有綜合各個(gè)預(yù)測結(jié)果才能提高抗原表位預(yù)測的準(zhǔn)確度。

圖5IEDB分析EM95的B細(xì)胞抗原表位

a: Chou ﹠Fasman β轉(zhuǎn)角預(yù)測；b: Emini 表面可及性預(yù)測；c: Karplus ﹠Schulzz柔韌性區(qū)域預(yù)測；d: Kolaskar ﹠ Tongaonkar 抗原性指數(shù)預(yù)測；e: Parker的親水性指數(shù)預(yù)測；f：Bepipred線性抗原表位預(yù)測

Fig.5TheparametersofEM95usingIEDBanalysis

a: Chou ﹠ Fasman Beta-Turn Prediction；b: Emini Surface Accessibility Prediction； c: Karplus ﹠ Schulzz Flexibility Prediction； d: Kolaskar ﹠ Tongaonkar Antigenicity Prediction； e: Parker Hydrophilicity Prediction； f：Bepipred Linear Epitope

EG95蛋白抗原作為免疫疫苗在保護(hù)中間宿主中獲得了很好的效果，EG95克隆重組抗原免疫中間宿主(羊)，在六鉤蚴感染實(shí)驗(yàn)中獲得96%～98%免疫保護(hù)效果[14]；Larrieu等[26]利用EG95蛋白抗原免疫了3 146只羔羊和311條家犬，同樣獲得了理想的保護(hù)效果，并進(jìn)一步證明EG95蛋白抗原疫苗能保護(hù)至3歲齡的動(dòng)物；同樣EG95蛋白抗原在免疫牛時(shí)也取得了理想的免疫效果[27]。而EM95蛋白抗原免疫中間宿主(嚙齒動(dòng)物)時(shí)，獲得的保護(hù)率低于EG95蛋白抗原免疫羊所取得的保護(hù)率。因此對EM95蛋白和EG95蛋白二級結(jié)構(gòu)及抗原表位分析將有助于找出兩種抗原的差異，為設(shè)計(jì)高效的EM95蛋白抗原提供思路。李玉嬌等[8]分析了EG95蛋白抗原的二級結(jié)構(gòu)及抗原表位，最終預(yù)測EG95蛋白可能存在7個(gè)潛在B細(xì)胞抗原表位，本研究利用了同樣的分析工具，對EM95蛋白進(jìn)行抗原表位預(yù)測，結(jié)果顯示EM95蛋白可能存在6個(gè)抗原表位區(qū)域。同時(shí)比對了兩種蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列，發(fā)現(xiàn)在預(yù)測EG95蛋白抗原表位7個(gè)區(qū)域中與EM95蛋白相對應(yīng)的位置均存在不同程度的氨基酸殘基替換，其中第1個(gè)抗原表位區(qū)域存在2個(gè)氨基酸殘基極性間替換(M替換為R、T替換為I)，第3個(gè)潛在表位存在1個(gè)(S替換為P)，第4個(gè)潛在抗原表位存在1個(gè)(T替換為A)，第6個(gè)潛在抗原表位存在1個(gè)(I替換為T)。氨基酸殘基極性間的替換可能對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)造成很大影響，分析EM95蛋白和EG95蛋白潛在抗原表位區(qū)域氨基酸的殘基差異將有助于闡釋EM95蛋白抗原保護(hù)力低于EG95蛋白的原因，為開發(fā)理想的EM95蛋白抗原疫苗奠定理論依據(jù)和提供指導(dǎo)。

4 小 結(jié)

本研究利用生物信息學(xué)工具對EM95蛋白的二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)以及B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了綜合預(yù)測，同時(shí)分析了EM95和EG95蛋白間的差異，為研發(fā)具有高效保護(hù)率的EM95蛋白抗原疫苗提供理論基礎(chǔ)及預(yù)防泡型包蟲病的流行奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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