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    青海高原鼠疫菌DFR分型及空間分布特征的研究

    2014-04-09 03:18:24楊曉艷魏柏青辛有全熊浩明魏榮杰祁美英李存香代瑞霞
    中國人獸共患病學(xué)報 2014年4期
    關(guān)鍵詞:疫源地青海高原田鼠

    楊曉艷,魏柏青,辛有全,靳 娟,何 建,熊浩明,魏榮杰,祁美英,李存香,金 泳,代瑞霞

    青海省自1954年證實存在鼠疫自然疫源地以來,全省有33個縣(市)、119個鄉(xiāng)(鎮(zhèn))被確定為鼠疫疫源地,疫點695處,疫源面積近20萬km2。青海高原鼠疫自然疫源地是目前我國動物間和人間鼠疫流行最嚴(yán)重的地區(qū)之一,至2012年的60年間,僅1984年、2007年、2008年和2012年無病例報告外,其余年間均有人間鼠疫發(fā)生。因此,迫切需要采用新的技術(shù)手段,針對這種具有重要公共衛(wèi)生意義的傳染病進(jìn)行深入研究,掌握其遺傳變異的規(guī)律、形成機(jī)理以及地域和時空分布特征,為制訂有效的防治策略,鼠疫菌的分型、溯源以及保障國家生物安全奠定基礎(chǔ)。為此,作者對青海高原1954年以來分離的839株鼠疫菌采用DFR技術(shù)對其進(jìn)行基因分型的研究。

    1 材料與方法

    1.1實驗菌株 共有839株鼠疫菌用于本研究。其中喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地829株,青海田鼠鼠疫自然疫源地10株。這些菌株涵蓋了青海高原鼠疫疫源地的不同時間、地區(qū)、宿主、媒介體內(nèi)分離的鼠疫菌,由青海國家鼠疫菌保藏中心提供。

    1.2鼠疫菌DNA的提取 將鼠疫菌培養(yǎng)于赫氏瓊脂培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)24 h,DNA提取按照經(jīng)典的苯酚-氯仿混合抽提法進(jìn)行[1]。

    1.3引物和PCR擴(kuò)增方法 鼠疫菌差異區(qū)段(Different Region,DFR)分型,使用23個DFR和PMT1(質(zhì)粒驗證引物)的擴(kuò)增引物(引物序列參見文獻(xiàn)[2])。PCR反應(yīng)體系:10×buffer 3 μL,10 mmol dNTP 0.1 μL, 5U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL, 10 μmoL引物對1 μL,模板DNA(2 ng/μL)5 μL, 用去離子水補(bǔ)足至30 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性40 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s共進(jìn)行30個循環(huán),最后72 ℃終延伸3 min。PCR產(chǎn)物檢測:擴(kuò)增結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳,用goldview 染料進(jìn)行染色,紫外燈下記錄結(jié)果,陽性結(jié)果記錄為“1”,陰性結(jié)果記錄為“0”。每次PCR檢測均設(shè)陰性對照(用去離子水取代模板)和陽性對照(模板為鼠疫菌菌株82009和620024 DNA的混合物,包括24個DFRs)。可疑PCR結(jié)果和陰性PCR結(jié)果至少重復(fù)1次。

    1.4地理信息系統(tǒng)(GIS) 運(yùn)用青海省地方病預(yù)防控制所地理信息系統(tǒng)(GIS)[3]進(jìn)行鼠疫菌基因型空間分布特征的分析。

    2 結(jié) 果

    2.1青海省鼠疫菌的基因分型 青海高原存在2種類型的鼠疫疫源地。被試的839株菌,共發(fā)現(xiàn)有11個基因組型。檢索包含909株中國鼠疫菌自然分離菌株的DFR分型數(shù)據(jù)庫[2],有8個基因組型與其相同,分別為1b、5、7、8、10、14、21、30型等基因組型,同時我們還發(fā)現(xiàn)了3個新的基因組型,即32、44、36。32型與5型接近,但32型缺失了DFR18;44型與8型接近,44型也缺失DFR18;36型亦與5型接近,但與5型相比缺少DFR10和DFR18。青海高原喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地以5、8型為主,青海高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因組型為14型。青海省鼠疫菌株23個DFR和PMT1(質(zhì)粒驗證引物)分布見表1。

    表1 24個DFR在青海省791株鼠疫菌中的分布狀態(tài)

    Note: “1” means PCR amplification showed positive; “0”means PCR amplification showed negative.

    2.2鼠疫菌基因型的空間分布特征 青海省鼠疫疫源地所分離的鼠疫菌基因型具有一定的地理分布特征,8型菌株的分布區(qū)為祁連山南麓、青海湖環(huán)湖地區(qū)、青海南山的祁連、門源、剛察、海晏、共和、天峻、烏蘭和宗務(wù)隆山的德令哈等地區(qū),占56.14%(471/839);5型菌株分布于青南高原的玉樹、雜多、治多、稱多、囊謙、曲麻萊和海西西部的格爾木等地區(qū),占23.12%(194/839);1b型菌株分布于冷湖、烏蘭、澤庫;7型菌株分布于循化、同仁、澤庫、德令哈、囊謙;32型菌株分布于格爾木的唐古拉地區(qū);44型菌株分布于祁連、門源;36型菌株分布于囊謙;唯獨(dú)囊謙地區(qū)有10型分布,其菌株分離自2004年一次肺鼠疫流行中的尸體和病人。在稱多縣青海田鼠分布區(qū),鼠疫菌基因型屬于14型,占1.19%(10/842)。見表2。

    表2 青海高原鼠疫耶爾森菌基因組型的地區(qū)分布

    Note:Focus C--Marmothimalayanplague foci; Focus M--Microtusfuscusplague foci

    3 討 論

    周冬生等[4]人利用全基因組芯片比較基因組學(xué)的研究獲得了鼠疫菌22 個差異區(qū)段(DFR),并將我國各鼠疫自然疫源地分離的 260 株鼠疫菌分成14 個基因組型。之后,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所又通過消減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了新的差異區(qū)段,并使用23個DFR的擴(kuò)增引物,對分離自我國的909株鼠疫菌進(jìn)行了DFR分型,將909株中國鼠疫菌分離株分成32個基因組型,根據(jù)疫源地與宿主的分布規(guī)律,提出了主要基因組型和次要基因組型的概念,前者與鼠疫菌在自然疫源地中的演化密切相關(guān)。因此,隨著盡可能多的DFR的發(fā)現(xiàn),DFR分型方法會日趨完善。

    青海省青海田鼠鼠疫自然疫源地是近年來新發(fā)現(xiàn)的一塊疫源地[5],青海田鼠是主要儲存宿主,細(xì)鉤黃鼠蚤和直緣雙蚤指名亞種為主要傳播媒介。分布于青海省稱多縣珍秦鄉(xiāng)境內(nèi),與四川省石渠縣接壤。截止目前青海田鼠鼠疫疫源地內(nèi)分離到的10株鼠疫菌均為14型。

    青海省喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地內(nèi)鼠疫菌基因型比較復(fù)雜,以5、8型為主。5型多分布在青海的青南高原和海西西部地區(qū); 8型菌株的分布區(qū)為祁連山南北麓、青海湖環(huán)湖地區(qū)及青海南山和宗務(wù)隆山等地區(qū);8型和5型的交匯處常同時有2~3種基因型的流行; 2004年青海省囊謙縣肺鼠疫暴發(fā)流行時所分離的8株菌株其基因組型全部為10型。新發(fā)現(xiàn)的3個基因組型,32型菌株分布于格爾木的唐古拉地區(qū);44型菌株分布于祁連、門源;36型菌株分布于囊謙。由于青海高原地形復(fù)雜,自然景觀垂直成帶十分明顯,景觀特征的多樣性使得地區(qū)間生態(tài)系差異較大,草甸草原幾乎占據(jù)整個青海;森林草甸草原出現(xiàn)于祁連山東部、玉樹東南部;昆侖山—阿爾金山山地以干旱的高山草原為主,鼠疫菌為了適應(yīng)不同的自然景觀,基因組型發(fā)生變化也就不可避免。

    參考文獻(xiàn):

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    [2]Li Y, Dai E, Cui Y, et al. Different region analysis for genotypingYersiniapestisisolates from China[J]. PLoS ONE, 2008, 3(5): e2166. DOI:10.1371/journal.pone.0002166

    [3]Tang XY, Wang GJ, Li Y, et al. The establishment of multi-diseases geographic information system for the endemic diseases in Qinghai province[J]. Chin J Endemiol, 2010, 29(6): 687-689. (in Chinese)

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    [4]Zhou DS, Han YP, Song YJ, et al. DNA microarray analysis of genome dynamics inYersiniapestis: insight into bacterial genome microevolution and niche adaptation[J]. Med J CPLA, 2004,29(3): 204-210. (in Chinese)

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    王祖鄖,羅松達(dá)衛(wèi),于曉濤,等.青海省青海田鼠鼠疫自然疫源地的發(fā)現(xiàn)與研究[J]. 中國地方病防治雜志, 2004, 23(1): 69-72.

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