電化學發(fā)光法檢測血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法學性能驗證

張凱，劉鷺，程建平，金躍，張建明

（淮安市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇淮安223002）

電化學發(fā)光法檢測血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法學性能驗證

張凱，劉鷺，程建平，金躍，張建明

（淮安市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇淮安223002）

目的：建立電化學發(fā)光法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）方法學性能驗證的方案。方法：應用美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）文件推薦的方法，通過羅氏Cobas E601免疫分析系統(tǒng)檢測血清NSE值，對其準確度、精密度、分析測量范圍、分析靈敏度和生物參考范圍進行性能驗證。結果：NSE準確度以相對偏倚表示，為2%～4%，批內變異系數(shù)＜1．0%，批間變異系數(shù)＜2．5%，分析靈敏度＜0．05 ng／mL，分析測量范圍為1．01～351．00 ng／mL，參考范圍為0．0～16．7 ng／mL。結論：ECLIA法檢測血清NSE性能參數(shù)和廠商聲明一致，其性能可以滿足臨床要求，驗證方案簡便易行。

電化學發(fā)光；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；方法學驗證

國際標準化組織（ISO）于2003年頒布了《醫(yī)學實驗室質量和能力的專用要求》（ISO 15189）作為醫(yī)學實驗室認可的標準，要求實驗室應對設備、檢測系統(tǒng)或者方法的主要分析性能進行驗證或確認，證實其能夠達到所要求的性能標準。《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》也明確提出，臨床實驗室應進行恰當?shù)姆椒▽W驗證以保證各項參數(shù)符合臨床使用需求。血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）是我科應用羅氏Cobas E601免疫分析系統(tǒng)的電化學發(fā)光法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）檢測的新項目，根據(jù)ISO 15189醫(yī)學實驗室認可標準、美國《臨床實驗室改進法規(guī)修正案》（CLIA′88）、衛(wèi)生部《三級綜合醫(yī)院評審標準實施細則》、《醫(yī)院檢驗科管理規(guī)范》等管理文件要求，檢測分析系統(tǒng)在應用于臨床實驗室之前，必須對其主要的分析性能包括變異系數(shù)（CV，即不精密度）、不準確度（偏倚）、分析測量范圍、分析靈敏度和生物參考范圍等主要指標進行驗證。因此，我科對其進行了多項參數(shù)驗證，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料1．1．1 儀器與試劑 Cobas E601全自動化學發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司），羅氏配套試劑（鏈霉親和素包被的微粒、生物素化抗NSE單克隆抗體、三聯(lián)吡啶釕標記的抗NSE單克隆抗體）、校準品以及質控品。

1．1．2 標本 高或低濃度NSE血清樣本來自我院常規(guī)檢測患者，參考范圍驗證所用血清樣本來自我院健康體檢者（血常規(guī)和常規(guī)生化體檢結果正常），男、女各20例，平均年齡（35．5±6．8）歲，其中女性排除月經(jīng)和妊娠，所有標本均無溶血，收集時間為2014年3月。

1．2 方法

1．2．1 樣本檢測 按Cobas E601操作規(guī)程對儀器進行系統(tǒng)維護保養(yǎng)，室內質控檢測結果在控后，按項目說明書要求收集空腹靜脈血液并分離血清，將血清與質控品、校準品或樣本稀釋液等按檢測程序進行檢測。

1．2．2 準確度驗證 參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）EP9-A2文件，用羅氏校準品（LOT：00169337，濃度為11．3 ng／mL和82．0 ng／mL），先對分析系統(tǒng)進行常規(guī)校準；再按程序檢測校準品，重復檢測3次求平均值，將所得驗證值與靶值進行比對，計算二者間的相對偏倚，如偏倚在±20%之內則驗證合格［1］。1．2．3 精密度驗證 參考EP5-A文件，選擇羅氏公司的質控血清（PC TM1：LOT 16995700；PC TM2：LOT 16995800）作為精密度驗證樣本，按NSE樣本檢測程序進行測定，每天重復3次，持續(xù)5 d，進行批內與批間精密度驗證，計算均值、標準差（s）和變異系數(shù)［2］。批內標準差（Sr）和批間標準差（Sb）D是總天數(shù)（即5 d），d是每天測定結果的平均值，n是每天重復測定總次數(shù)（即3次），i是次數(shù)，1次，2次或3次是每天重復測定的結果，是每天所有檢測結果的平均值是所有5天的和除以總的天數(shù)。

1．2．4 分析測量范圍（analyticalmeasurement range，AMR）驗證 按CLSI EP6-A2文件，選擇2份檢測NSE的患者血清，分別為低濃度（L，1．01 ng／mL）和高濃度（H，351．0 ng／mL），按5L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、5H的比例關系配制成6份不同濃度的混合血清，每份血清重復檢測3次取平均值，對6份系列濃度混合血清樣本的檢測平均值與預期值進行多項式回歸統(tǒng)計，比較實測值（Y）與預期值（X），計算回歸方程后確定NSE的線性范圍［3］。

1．2．5 分析靈敏度驗證 參考文獻［4］，以Elecsys通用稀釋液作為空白樣品測定20次，記錄每次發(fā)光強度值和濃度值，如超過空白檢測限（Limit of blank，LoB）的值不超過3個，則給出的LoB值可用［4］。

1．2．6 生物參考范圍驗證 采集2014年3月在我院體檢中心體檢者（常規(guī)生化與血常規(guī)體檢均正常）空腹血清，男女各20例，按檢測程序進行檢測，要求不超過10%數(shù)據(jù)（即不多于4個）在廠商給的生物參考范圍之外，否則NSE的生物參考范圍需重新建立［5］。

1．3 統(tǒng)計分析

準確度、精密度驗證數(shù)據(jù)計算與處理采用Office 2010 Excel軟件。AMR驗證應用SPSS 18．0軟件統(tǒng)計分析處理，采用多項式回歸分析法，回歸系數(shù)用bi表示，一次、二次、三次回歸分析方程分別為Y＝b0＋b1X、Y＝b0＋b1X＋b2X2、Y＝b0＋b1X＋b2X2＋b3X3，其中b2和b3為非線性系數(shù)斜率，計算bi的標準差SEi，然后行t檢驗判斷b2和b3與0之間差異有無統(tǒng)計學意義，如差異無統(tǒng)計學意義，則預期值與實測值關系為線性。

2 結果

2．1 準確度驗證結果

與羅氏NSE校準品相比，準確度驗證的2份校準品檢測結果的偏倚分別是2．02%和3．72%，都在±20%范圍內，符合相關文件的要求。見表1。

2．2 精密度驗證結果

結果顯示，2份質控品批內CV分別為0．81%和0．91%，批間CV分別為2．4%和2．3%，均符合羅氏公司的NSE項目說明書參數(shù)（≤10%）。見表2。

2．3 AMR驗證結果

經(jīng)多項式回歸分析得到b2＝5．4×10－6，b3＝4．4×10－7，經(jīng)t檢驗與0比較，P均＞0．05，說明二者與0差異無統(tǒng)計學意義，所以預期值與實測值間為線性關系，線性方程為Y＝0．204＋1．001 2X（F＝145 724，P＜0．001）；截距b0與0比較差異無統(tǒng)計學意義（t＝0．733，P＞0．05）；斜率b1與0比較，差異有統(tǒng)計學意義（t＝381．7，P＜0．001），說明預期值與實測值間有真實的線性關系。故本次實驗的線性范圍在1．01～351．00 ng／mL之間。見表3。

2．4 分析靈敏度驗證結果

結果顯示，沒有超過LoB值（＜0．05 ng／mL）的數(shù)值，說明廠商提供的參數(shù)（＜0．05 ng／mL）可用。

2．5 生物參考范圍驗證結果

結果顯示，有2例檢測結果超過范圍（分別為18．52 ng／mL和20．21 ng／mL），其余結果均為0～16．7 ng／mL，在廠商提供的參考范圍之內，說明該NSE參考范圍可以接受。

3 討論

NSE是一種參與糖酵解途徑的烯醇化酶，在神經(jīng)組織和神經(jīng)內分泌組織細胞以及其所引發(fā)的腫瘤細胞中呈高表達。NSE可作為監(jiān)測小細胞肺癌的首選標志物，與臨床疾病進展有良好的相關性。神經(jīng)母細胞瘤和精原細胞瘤中NSE濃度明顯增加［6］。

準確度通常由對定值的質控品或校準品進行檢測并計算偏倚，或與參考檢測系統(tǒng)以及其他標準方法進行方法比對和偏倚評估來確定。本文先對E601發(fā)光儀進行校準；再檢測校準品，將檢測結果與靶值進行比對，計算二者間相對偏倚，結果顯示2份校準品與靶值的偏倚均在美國《臨床實驗室改進法規(guī)修正案》（CLIA’88）允許誤差范圍內。精密度是進行方法學性能驗證的前提，是一個反映檢測系統(tǒng)整體性能的指標，是指檢測系統(tǒng)在特定條件下，多個獨立的測試結果間的一致程度。本研究參考CLSIEP5-A文件以2個濃度水平羅氏質控品為實驗樣本，最后得到批內和批間變異系數(shù)，方法簡便易行，適合于普通臨床實驗室應用。

AMR是指患者樣本未經(jīng)稀釋和濃縮等任何預處理，由檢測方法獲得的測定值范圍［7］。經(jīng)過本次驗證，E601分析系統(tǒng)在我室測定NSE的AMR與廠商說明書提供的相近；分析靈敏度驗證結果也和廠商提供數(shù)據(jù)一致；40份健康體檢者樣本血清中NSE濃度除2例偏高外，均在儀器說明書的參考范圍之內，按照CLSIC28-A文件的要求，可以直接使用廠商提供的參考范圍。

目前國內尚沒有ECLIA法檢測NSE方法學性能驗證方面的報道，所以本研究對Cobas E601檢測系統(tǒng)測定血清NSE的一些方法學性能進行驗證，驗證結果與廠商提供的性能指標基本一致，為臨床實驗室應用該項目提供了準確和可靠的依據(jù)，對于規(guī)范定量免疫檢驗，提高檢驗質量有著重要意義。因實驗成本和其他客觀因素，本研究尚有許多缺陷，如驗證生物參考范圍用的樣本例數(shù)較少，目前江蘇省NSE尚不是室間質評項目而無法將其用于準確度驗證中，我們將在下一步實驗中加以完善。

［1］ CLSI．EP09-A2-IR．Method comparison and bias estimation using patient sample；approved guideline-second edition［S］．PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2002．

［2］ NCCLS．EP15-A．User demonstration of performance for precision and accuracy；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2001．

［3］ NCCLS．EP6-A．Evaluation of the linearity of quantitativemeasurement procedures：a statistical approach；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2003．

［4］ NCCLS．EP17-A．Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2004．

［5］ NCCLS．C28-A2．How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory：second edition［S］．Pennsylvania：USA，2000．

［6］ Za??ska M，Szturmowicz M，Zych J，etal．Elevated serum NSE level in locally advanced and metastatic NSCLC predispose to better response to chemotherapy but worse survival［J］．Pneumonol Alergol Pol，2010，78（1）：14－20．

［7］ 許斌．醫(yī)院檢驗科建設管理規(guī)范［M］．2版．南京：東南大學出版社，2013：235．

R446．69

B

1671－7783（2014）05－0455－03

10．13312／j．issn．1671-7783．y140175

2014－06－22 ［編輯］ 劉星星