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    電化學發(fā)光法檢測血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法學性能驗證

    2014-04-14 05:29:14張凱劉鷺程建平金躍張建明
    江蘇大學學報(醫(yī)學版) 2014年5期
    關鍵詞:精密度準確度實驗室

    張凱,劉鷺,程建平,金躍,張建明

    (淮安市第二人民醫(yī)院檢驗科,江蘇淮安223002)

    電化學發(fā)光法檢測血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法學性能驗證

    張凱,劉鷺,程建平,金躍,張建明

    (淮安市第二人民醫(yī)院檢驗科,江蘇淮安223002)

    目的:建立電化學發(fā)光法(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)方法學性能驗證的方案。方法:應用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)文件推薦的方法,通過羅氏Cobas E601免疫分析系統(tǒng)檢測血清NSE值,對其準確度、精密度、分析測量范圍、分析靈敏度和生物參考范圍進行性能驗證。結果:NSE準確度以相對偏倚表示,為2%~4%,批內變異系數(shù)<1.0%,批間變異系數(shù)<2.5%,分析靈敏度<0.05 ng/mL,分析測量范圍為1.01~351.00 ng/mL,參考范圍為0.0~16.7 ng/mL。結論:ECLIA法檢測血清NSE性能參數(shù)和廠商聲明一致,其性能可以滿足臨床要求,驗證方案簡便易行。

    電化學發(fā)光;神經(jīng)元特異性烯醇化酶;方法學驗證

    國際標準化組織(ISO)于2003年頒布了《醫(yī)學實驗室質量和能力的專用要求》(ISO 15189)作為醫(yī)學實驗室認可的標準,要求實驗室應對設備、檢測系統(tǒng)或者方法的主要分析性能進行驗證或確認,證實其能夠達到所要求的性能標準。《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》也明確提出,臨床實驗室應進行恰當?shù)姆椒▽W驗證以保證各項參數(shù)符合臨床使用需求。血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)是我科應用羅氏Cobas E601免疫分析系統(tǒng)的電化學發(fā)光法(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)檢測的新項目,根據(jù)ISO 15189醫(yī)學實驗室認可標準、美國《臨床實驗室改進法規(guī)修正案》(CLIA′88)、衛(wèi)生部《三級綜合醫(yī)院評審標準實施細則》、《醫(yī)院檢驗科管理規(guī)范》等管理文件要求,檢測分析系統(tǒng)在應用于臨床實驗室之前,必須對其主要的分析性能包括變異系數(shù)(CV,即不精密度)、不準確度(偏倚)、分析測量范圍、分析靈敏度和生物參考范圍等主要指標進行驗證。因此,我科對其進行了多項參數(shù)驗證,現(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料1.1.1 儀器與試劑 Cobas E601全自動化學發(fā)光分析儀(瑞士羅氏公司),羅氏配套試劑(鏈霉親和素包被的微粒、生物素化抗NSE單克隆抗體、三聯(lián)吡啶釕標記的抗NSE單克隆抗體)、校準品以及質控品。

    1.1.2 標本 高或低濃度NSE血清樣本來自我院常規(guī)檢測患者,參考范圍驗證所用血清樣本來自我院健康體檢者(血常規(guī)和常規(guī)生化體檢結果正常),男、女各20例,平均年齡(35.5±6.8)歲,其中女性排除月經(jīng)和妊娠,所有標本均無溶血,收集時間為2014年3月。

    1.2 方法

    1.2.1 樣本檢測 按Cobas E601操作規(guī)程對儀器進行系統(tǒng)維護保養(yǎng),室內質控檢測結果在控后,按項目說明書要求收集空腹靜脈血液并分離血清,將血清與質控品、校準品或樣本稀釋液等按檢測程序進行檢測。

    1.2.2 準確度驗證 參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)EP9-A2文件,用羅氏校準品(LOT:00169337,濃度為11.3 ng/mL和82.0 ng/mL),先對分析系統(tǒng)進行常規(guī)校準;再按程序檢測校準品,重復檢測3次求平均值,將所得驗證值與靶值進行比對,計算二者間的相對偏倚,如偏倚在±20%之內則驗證合格[1]。1.2.3 精密度驗證 參考EP5-A文件,選擇羅氏公司的質控血清(PC TM1:LOT 16995700;PC TM2:LOT 16995800)作為精密度驗證樣本,按NSE樣本檢測程序進行測定,每天重復3次,持續(xù)5 d,進行批內與批間精密度驗證,計算均值、標準差(s)和變異系數(shù)[2]。批內標準差(Sr)和批間標準差(Sb)D是總天數(shù)(即5 d),d是每天測定結果的平均值,n是每天重復測定總次數(shù)(即3次),i是次數(shù),1次,2次或3次是每天重復測定的結果,是每天所有檢測結果的平均值是所有5天的和除以總的天數(shù)。

    1.2.4 分析測量范圍(analyticalmeasurement range,AMR)驗證 按CLSI EP6-A2文件,選擇2份檢測NSE的患者血清,分別為低濃度(L,1.01 ng/mL)和高濃度(H,351.0 ng/mL),按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H的比例關系配制成6份不同濃度的混合血清,每份血清重復檢測3次取平均值,對6份系列濃度混合血清樣本的檢測平均值與預期值進行多項式回歸統(tǒng)計,比較實測值(Y)與預期值(X),計算回歸方程后確定NSE的線性范圍[3]。

    1.2.5 分析靈敏度驗證 參考文獻[4],以Elecsys通用稀釋液作為空白樣品測定20次,記錄每次發(fā)光強度值和濃度值,如超過空白檢測限(Limit of blank,LoB)的值不超過3個,則給出的LoB值可用[4]。

    1.2.6 生物參考范圍驗證 采集2014年3月在我院體檢中心體檢者(常規(guī)生化與血常規(guī)體檢均正常)空腹血清,男女各20例,按檢測程序進行檢測,要求不超過10%數(shù)據(jù)(即不多于4個)在廠商給的生物參考范圍之外,否則NSE的生物參考范圍需重新建立[5]。

    1.3 統(tǒng)計分析

    準確度、精密度驗證數(shù)據(jù)計算與處理采用Office 2010 Excel軟件。AMR驗證應用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計分析處理,采用多項式回歸分析法,回歸系數(shù)用bi表示,一次、二次、三次回歸分析方程分別為Y=b0+b1X、Y=b0+b1X+b2X2、Y=b0+b1X+b2X2+b3X3,其中b2和b3為非線性系數(shù)斜率,計算bi的標準差SEi,然后行t檢驗判斷b2和b3與0之間差異有無統(tǒng)計學意義,如差異無統(tǒng)計學意義,則預期值與實測值關系為線性。

    2 結果

    2.1 準確度驗證結果

    與羅氏NSE校準品相比,準確度驗證的2份校準品檢測結果的偏倚分別是2.02%和3.72%,都在±20%范圍內,符合相關文件的要求。見表1。

    2.2 精密度驗證結果

    結果顯示,2份質控品批內CV分別為0.81%和0.91%,批間CV分別為2.4%和2.3%,均符合羅氏公司的NSE項目說明書參數(shù)(≤10%)。見表2。

    2.3 AMR驗證結果

    經(jīng)多項式回歸分析得到b2=5.4×10-6,b3=4.4×10-7,經(jīng)t檢驗與0比較,P均>0.05,說明二者與0差異無統(tǒng)計學意義,所以預期值與實測值間為線性關系,線性方程為Y=0.204+1.001 2X(F=145 724,P<0.001);截距b0與0比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.733,P>0.05);斜率b1與0比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=381.7,P<0.001),說明預期值與實測值間有真實的線性關系。故本次實驗的線性范圍在1.01~351.00 ng/mL之間。見表3。

    2.4 分析靈敏度驗證結果

    結果顯示,沒有超過LoB值(<0.05 ng/mL)的數(shù)值,說明廠商提供的參數(shù)(<0.05 ng/mL)可用。

    2.5 生物參考范圍驗證結果

    結果顯示,有2例檢測結果超過范圍(分別為18.52 ng/mL和20.21 ng/mL),其余結果均為0~16.7 ng/mL,在廠商提供的參考范圍之內,說明該NSE參考范圍可以接受。

    3 討論

    NSE是一種參與糖酵解途徑的烯醇化酶,在神經(jīng)組織和神經(jīng)內分泌組織細胞以及其所引發(fā)的腫瘤細胞中呈高表達。NSE可作為監(jiān)測小細胞肺癌的首選標志物,與臨床疾病進展有良好的相關性。神經(jīng)母細胞瘤和精原細胞瘤中NSE濃度明顯增加[6]。

    準確度通常由對定值的質控品或校準品進行檢測并計算偏倚,或與參考檢測系統(tǒng)以及其他標準方法進行方法比對和偏倚評估來確定。本文先對E601發(fā)光儀進行校準;再檢測校準品,將檢測結果與靶值進行比對,計算二者間相對偏倚,結果顯示2份校準品與靶值的偏倚均在美國《臨床實驗室改進法規(guī)修正案》(CLIA’88)允許誤差范圍內。精密度是進行方法學性能驗證的前提,是一個反映檢測系統(tǒng)整體性能的指標,是指檢測系統(tǒng)在特定條件下,多個獨立的測試結果間的一致程度。本研究參考CLSIEP5-A文件以2個濃度水平羅氏質控品為實驗樣本,最后得到批內和批間變異系數(shù),方法簡便易行,適合于普通臨床實驗室應用。

    AMR是指患者樣本未經(jīng)稀釋和濃縮等任何預處理,由檢測方法獲得的測定值范圍[7]。經(jīng)過本次驗證,E601分析系統(tǒng)在我室測定NSE的AMR與廠商說明書提供的相近;分析靈敏度驗證結果也和廠商提供數(shù)據(jù)一致;40份健康體檢者樣本血清中NSE濃度除2例偏高外,均在儀器說明書的參考范圍之內,按照CLSIC28-A文件的要求,可以直接使用廠商提供的參考范圍。

    目前國內尚沒有ECLIA法檢測NSE方法學性能驗證方面的報道,所以本研究對Cobas E601檢測系統(tǒng)測定血清NSE的一些方法學性能進行驗證,驗證結果與廠商提供的性能指標基本一致,為臨床實驗室應用該項目提供了準確和可靠的依據(jù),對于規(guī)范定量免疫檢驗,提高檢驗質量有著重要意義。因實驗成本和其他客觀因素,本研究尚有許多缺陷,如驗證生物參考范圍用的樣本例數(shù)較少,目前江蘇省NSE尚不是室間質評項目而無法將其用于準確度驗證中,我們將在下一步實驗中加以完善。

    [1] CLSI.EP09-A2-IR.Method comparison and bias estimation using patient sample;approved guideline-second edition[S].PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2002.

    [2] NCCLS.EP15-A.User demonstration of performance for precision and accuracy;approved guideline[S].Pennsylvania:USA,2001.

    [3] NCCLS.EP6-A.Evaluation of the linearity of quantitativemeasurement procedures:a statistical approach;approved guideline[S].Pennsylvania:USA,2003.

    [4] NCCLS.EP17-A.Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation;approved guideline[S].Pennsylvania:USA,2004.

    [5] NCCLS.C28-A2.How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory:second edition[S].Pennsylvania:USA,2000.

    [6] Za??ska M,Szturmowicz M,Zych J,etal.Elevated serum NSE level in locally advanced and metastatic NSCLC predispose to better response to chemotherapy but worse survival[J].Pneumonol Alergol Pol,2010,78(1):14-20.

    [7] 許斌.醫(yī)院檢驗科建設管理規(guī)范[M].2版.南京:東南大學出版社,2013:235.

    R446.69

    B

    1671-7783(2014)05-0455-03

    10.13312/j.issn.1671-7783.y140175

    2014-06-22 [編輯] 劉星星

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