咳喘顆粒劑對熱型哮喘患兒外周血Th1／Th2細胞的影響

王海生，王武強，劉小林，薛建華，吳玉芳，馬梅香

（常州市武進中醫(yī)醫(yī)院1．檢驗科；2．中醫(yī)兒科，江蘇常州213161）

咳喘顆粒劑對熱型哮喘患兒外周血Th1／Th2細胞的影響

王海生1，王武強2，劉小林1，薛建華1，吳玉芳1，馬梅香1

（常州市武進中醫(yī)醫(yī)院1．檢驗科；2．中醫(yī)兒科，江蘇常州213161）

目的：探討咳喘顆粒劑對熱型哮喘患兒外周血Th1／Th2細胞的作用。方法：48例熱型哮喘患兒隨機分為顆粒組和常規(guī)組，各24例；常規(guī)組口服中藥咳喘顆粒劑，3次／d，3 d為1個療程，治療2個療程；常規(guī)組采用常規(guī)西藥治療，布地奈德粉吸入劑（100μg／吸）和硫酸特布他林氣霧劑（0．25 mg／噴），2次／d，治療1周；另取20名健康兒童作為對照組。實時定量PCR檢測各組外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中T細胞表達的T盒（T-box expressed in T cells，T-bet）mRNA和GATA連接蛋白3（GATA binding-3，GATA-3）mRNA的表達；ELISA法檢測各組血漿IFN-γ和IL-4水平。結(jié)果：顆粒組和常規(guī)組總有效率分別為95．83%、91．67%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0．559，P＞0．05）。治療前，顆粒組和常規(guī)組GATA-3 mRNA和IL-4水平明顯高于對照組（P＜0．01），T-betmRNA和IFN-γ水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），而T-betmRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4明顯低于對照組（P＜0．01）。治療后，3組GATA-3 mRNA、T-betmRNA、IL-4、IFN-γ水平及T-betmRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4比值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0．05）；但與治療前相比，顆粒組和常規(guī)組GATA-3 mRNA和IL-4水平明顯降低（P＜0．01），T-betmRNA／GATA-3mRNA和IFN-γ／IL-4明顯升高（P＜0．01），T-betmRNA和IFN-γ表達僅輕度增加（P＞0．05）。結(jié)論：咳喘顆粒劑通過抑制Th2細胞，糾正Th1／Th2細胞平衡治療患兒熱型哮喘。

咳喘顆粒劑；熱型哮喘；兒童；Th1細胞；Th2細胞

支氣管哮喘是兒科的常見病和多發(fā)病，免疫學研究表明，機體Th1／Th2細胞失衡，Th2細胞極化所引起的局部嗜酸性粒細胞浸潤和氣道高反應(yīng)性是其發(fā)病重要機制［1］?？却w粒劑是我院名老中醫(yī)經(jīng)驗方，臨床用于治療兒童熱型哮喘達10多年，效果明顯［2－3］。本研究擬以熱型哮喘患兒為研究對象，檢測咳喘顆粒劑治療前后外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中Th1／Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子，即T細胞表達的T盒（T-box expressed in T cells，T-bet）和GATA連接蛋白3（GATA binding-3，GATA-3）及細胞因子IL-4、IFN-γ水平的變化，探討咳喘顆粒劑對熱型哮喘患兒外周血Th1／Th2細胞的影響。

1 對象和方法

1．1 對象

選擇2012年5月至2014年1月于常州市武進中醫(yī)院兒科門診就診的熱型哮喘患兒。診斷標準：符合1994年中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準《中醫(yī)病證診斷與療效標準》。納入標準：中醫(yī)屬熱型哮喘者；病情嚴重程度分級屬于《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》第2～3級者；年齡4～14歲；患兒父母簽署知情同意書。排除標準：合并肺部感染者；病情嚴重程度分級屬于《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》第4級者；合并先天性心臟病或因其他原發(fā)病所致哮喘者［2］。

將符合入選條件的48例患兒隨機分為2組。顆粒組24例，其中男11例，女13例，年齡4～14歲，平均（7．6±3．6）歲，病程6個月～2年。常規(guī)組24例，其中男10例，女14例，年齡5～14歲，平均（7．9±4．1）歲，病程6個月～2．5年。另選取20例健康體檢兒童作對照組，其中男8例，女12例，年齡5～14歲，平均（7．3±3．5）歲。各組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0．05）。

1．2 方法

1．2．1 治療方法 顆粒組采用中藥咳喘顆粒劑治療，其組成為蜜麻黃3 g、杏仁10 g、白前10 g、蟬蛻6 g、甘草3 g、姜半夏6 g、葶藶子10 g、地龍10 g、浙貝母10 g、川芎10 g、金蕎麥15 g、魚腥草15 g（江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司），開水沖服，3次／d，3 d為1個療程，治療2個療程。常規(guī)組采用常規(guī)西藥吸入治療，布地奈德粉吸入劑（AstraZeneca公司，100 μg／吸）和硫酸特布他林氣霧劑（AstraZeneca公司，0．25 mg／噴），2次／d，治療1周，1周后復(fù)診。

1．2．2 療效評定標準 臨床控制：哮喘癥狀完全控制，體征消失；顯效：哮喘癥狀明顯減輕，發(fā)作次數(shù)明顯減少；有效：哮喘癥狀減輕，仍需服藥維持；無效：病情無變化或加重。

1．2．3 主要試劑和儀器 Ficoll淋巴細胞分離液（上海華精生物高科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ToYoBo有限公司），SYBR GreenⅠ實時PCR試劑盒（杭州Bioer公司），IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒（eBioscience公司），7300熒光定量PCR儀（ABI公司），680酶標儀（Bio-Rad公司）。

1．2．4 樣本處理 采集EDTA抗凝靜脈血2 mL，收集血漿于－70℃保存，然后用Ficoll淋巴細胞分離液分離PBMC，加入1 mL Trizol裂解細胞，提取總RNA?？俁NA先于65℃熱變性5 min，然后再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μL；反轉(zhuǎn)錄酶混合物1μL；引物混合物1μL；總核糖核酸模板2μg；無核酸酶滅菌水補足至20μL，于PCR儀上反應(yīng)，37℃15 min，98℃5 min，4℃5 min。合成的cDNA于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．5 T-bet、GATA-3 mRNA檢測 利用Premier 5．0軟件，根據(jù)NCBI基因庫中T-bet、GATA-3mRNA保守序列設(shè)計定量PCR引物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中T-bet：上游，5′-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3′；下游，5′-CTTG-GAAAGTAAAGATATGCGTG-3′；擴增片段129 bp。GATA-3：上游，5′-GTAGCTGTAAGGCAGAAGGATG-3′；下游，5′-ACTGGTGAACGGTAACACTGATT-3′；擴增片段279 bp。β-肌動蛋白：上游，5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′；下游，5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′；擴增片段262 bp［4］。反應(yīng)體系：2× SYBR混合物12．5μL；上下游引物（10μmol／L）各0．5μL；Taq酶0．15μL；cDNA 2μL；ROX校準染料（50×）0．5μL；雙蒸水補足至25μL。定量PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性2 min；94℃10 s；60℃15 s；72℃30 s；擴增40個循環(huán)。mRNA相對表達量＝2－△CT，其中

1．2．6 IFN-γ、IL-4檢測 采用ELISA法檢測，嚴格按照eBioscience公司試劑說明書操作，經(jīng)酶標儀定量。其中，IFN-γ、IL-4靈敏度分別為4 pg／mL、2 pg／mL。

1．3 統(tǒng)計分析

利用SPSS 15．0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差±s）表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 顆粒組與常規(guī)組臨床療效的比較

顆粒組臨床控制12例，顯效6例，有效5例，無效1例，總有效率95．83%；常規(guī)組臨床控制11例，顯效5例，有效6例，無效2例，總有效率91．67%；二組總有效率相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0．559，P＞0．05）。

2．2 各組PBMC中T-betmRNA和GATA-3 mRNA水平的比較

治療前，3組PBMC中GATA-3 mRNA表達及T-betmRNA／GATA-3 mRNA比值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F分別為41．241，50．062，P均＝0．000），T-betmRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（F＝1．309，P＝0．228）。顆粒組和常規(guī)組PBMC中GATA-3 mRNA表達均明顯高于對照組（P均＜0．01），而T-betmRNA／GATA-3 mRNA比值均明顯低于對照組（P均＜0．01）。

治療后，3組PBMC中GATA-3 mRNA、T-bet mRNA表達及T-betmRNA／GATA-3 mRNA比值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（F分別為0．984，0．909，1．235，P分別為0．281，0．308，0．246）；但與治療前相比，顆粒組和常規(guī)組PBMC中GATA-3 mRNA表達明顯下降（P均＜0．01），T-bet mRNA／GATA-3 mRNA比值明顯升高（P均＜0．01），而T-betmRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0．05）。見表1。

2．3 各組血漿中IFN-γ和IL-4水平的比較

治療前，3組血漿中IL-4水平及IFN-γ／IL-4比值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F值分別為52．478，73．404，P值均＝0．000），而IFN-γ水平差異無統(tǒng)計學意義（F＝0．824，P＝0．319）。顆粒組和常規(guī)組血漿中IL-4水平均明顯高于對照組（P＜0．01），而IFN-γ／IL-4比值均明顯低于對照組（P＜0．01）。

治療后，3組血漿中IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ／IL-4比值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（F分別為0．964，1．525，1．299，P分別為0．296，0．183，0．231）；但與治療前相比，顆粒組和常規(guī)組血漿中IL-4水平均明顯下降（P均＜0．01），IFN-γ／IL-4比值均明顯升高（P均＜0．01），IFN-γ水平略有上升，但差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0．05）。見表2。

3 討論

T-bet和GATA-3是控制初始T細胞分別向Th1細胞和Th2細胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［5－6］。支氣管哮喘因氣道局部微環(huán)境的改變致使初始T細胞GATA-3表達增加，進而向Th2細胞轉(zhuǎn)化，具體表現(xiàn)為Th2細胞亢進，Th2細胞相關(guān)的細胞因子IL-4、IL-5、IL-13等表達增多，而T-bet和Th1細胞相關(guān)的細胞因子IFN-γ、IL-2等表達受限，最終表現(xiàn)為Th1／Th2失衡。研究表明，西藥糖皮質(zhì)激素可通過抑制p38 MAP來間接抑制GATA-3及其下游IL-4等細胞因子的表達，從而控制哮喘癥狀［7］。而一些動物實驗研究表明，中藥（如三拗湯、培本中藥及麻杏甘石湯等）亦可通過抑制支氣管哮喘大鼠肺組織GATA-3 mRNA的表達，降低肺泡中IL-4水平，進而改善氣道炎癥［8－10］。此外，臨床醫(yī)師在用銀杏葉片聯(lián)合布地奈德吸入治療中、重度哮喘患兒時發(fā)現(xiàn)，銀杏葉制劑通過拮抗血小板活化因子的作用，明顯降低其IL-4水平和IL-4／IFN-γ的比值，從而提高臨床癥狀控制率［11］。由此可見，通過抑制Th2細胞，糾正Th1／Th2細胞的平衡可有效控制哮喘。

表1 各組PBMC中T-betmRNA和GATA-3 mRNA的比較 ±s

a：P＜0．01，與對照組比較

T-betmRNA／GATA-3 mRNA顆粒組 治療前 24 3．89±1．17 8．13±2．56a 0．47±0．12組別 n T-betmRNA（×10－3） GATA-3 mRNA（×10－3）a治療后 4．13±1．20 3．39±1．02 1．21±0．39 t值 1．21 7．14 8．39 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01常規(guī)組 治療前 24 3．91±1．19 7．93±2．37a 0．49±0．14a治療后 4．20±1．23 3．41±0．91 1．24±0．41 t值 1．09 6．93 7．68 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01對照組20 3．95±1．21 3．32±0．84 1．18±0．37

表2 各組血漿中IFN-γ和IL-4水平的比較 ±s

a：P＜0．01，與對照組比較

／IL-4顆粒組 治療前 24 9．01±2．32 34．78±7．03a 0．31±0．07組別 n IFN-γ（pg／mL） IL-4（pg／mL） IFN-γ a治療后 11．25±3．54 8．23±2．87 1．37±0．29 t值 1．13 8．05 9．16 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01常規(guī)組 治療前 24 8．89±2．10 33．21±6．65a 0．29±0．05a治療后 10．92±3．26 8．01±2．69 1．38±0．28 t值 0．97 7．71 9．59 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01對照組20 9．34±2．99 7．54±2．41 1．31±0．24

中醫(yī)認為哮喘是因機體肺、脾、腎三臟不足，痰飲留伏，外因誘發(fā)，觸動伏痰，痰阻氣道所致。小兒哮喘因其生理特點，發(fā)作易從熱化，辨證屬熱型哮喘者居多，故治療多從痰熱入手?？却w粒劑正是基于這一理論所創(chuàng)，具有宣發(fā)肺氣、止咳平喘、通暢肺絡(luò)、清熱化痰、活血化瘀等功效，臨床應(yīng)用于兒童輕、中度熱型哮喘急性發(fā)作期的治療。本研究顯示，咳喘顆粒劑治療兒童熱型哮喘療效與常規(guī)西藥一致（P＞0．05）；熱型哮喘患兒外周血中Th2細胞相關(guān)因子（GATA-3和IL-4）表達明顯增強（P＜0．01），而Th1細胞相關(guān)因子（T-bet和IFN-γ）的表達并無明顯改變（P＞0．05），且外周血中Th1與Th2細胞相關(guān)因子的比值（T-bet mRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4）均明顯偏低（P＜0．01），均提示熱型哮喘患兒體內(nèi)存在著Th1／Th2細胞失衡和Th2細胞過度活化；過度活化的Th2細胞產(chǎn)生較多的細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等導(dǎo)致氣道慢性炎癥，與唐丹等［12］研究結(jié)果相似。此外，顆粒組患兒外周血中Th2細胞相關(guān)因子（GATA-3和IL-4）的表達均較治療前明顯降低，Th1與Th2細胞相關(guān)因子的比值（T-betmRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4）均較治療前明顯增加，臨床癥狀得到明顯改善［2］，肺功能明顯提高［3］，而其外周血中Th1細胞相關(guān)因子（T-bet和IFN-γ）的表達僅有輕度增加（P＞0．05），說明咳喘顆粒劑主要通過影響體內(nèi)Th2細胞而使哮喘得到緩解。由于哮喘病理機制復(fù)雜，治療后易復(fù)發(fā)，故急性發(fā)作期輕、中度熱型哮喘患兒經(jīng)咳喘顆粒劑治療進入緩解期后仍需吸入糖皮質(zhì)激素，或根據(jù)緩解期不同的中醫(yī)證型服用相應(yīng)的中藥以鞏固療效，防止日后復(fù)發(fā)。

綜上所述，熱型哮喘患兒體內(nèi)存在著Th2細胞亢進，Th1／Th2細胞失衡，咳喘顆粒劑可通過抑制Th2細胞，糾正Th1／Th2細胞失衡。由于咳喘顆粒劑由10多種中藥組成，生物活性成分較復(fù)雜，故要明確其中各中藥確切的作用機制，還需對其拆方作進一步研究。

［1］ Tomkinson A，Duez C，Cieslewicz G，et al．A murine IL-4 receptor antagonist that inhibits IL-4-and IL-13-induced responses prevents antigen-induced airway eosinophilia and airway hyperresponsiveness［J］．J Immunol，2001，166（9）：5792－5800．

［2］ 王武強，王耀峰，張建玉，等．咳喘合劑治療兒童哮喘熱哮證56例臨床觀察［J］．江蘇中醫(yī)藥，2006，27（11）：37－38．

［3］ 王武強，王耀峰，張建玉．咳喘合劑治療兒童哮喘熱哮證58例肺功能變化觀察［J］．上海醫(yī)藥，2008，29（6）：269－270．

［4］ 吳蔚，王勝軍，李遇梅，等．皮肌炎患者外周血CD4＋T細胞中TGF-β1 mRNA表達及意義［J］．江蘇大學學報：醫(yī)學版，2008，18（3）：255－257．

［5］ ZhengW，F(xiàn)lavell RA．The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells［J］．Cell，1997，89（4）：587－596．

［6］ Szabo SJ，Sullivan BM，Stemmann C，et al．Distinct effects of T-bet in TH1 lineage commitment and IFN-γ production in CD4 and CD8 T cells［J］．Science，2002，295（5553）：338－342．

［7］ Barnes PJ．Role of GATA-3 in allergic diseases［J］．Curr Mol Med，2008，8（5）：330－334．

［8］ 陳慧，馬融．三拗湯對支氣管哮喘大鼠Th1，Th2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制的研究［J］．中國中藥雜志，2012，37（9）：1324－1326．

［9］ 劉仁慧，王秀娟，許利平，等．培本中藥及其拆方調(diào)節(jié)哮喘大鼠Th1／Th2細胞平衡的實驗研究［J］．北京中醫(yī)藥大學學報，2014，37（3）：165－170，183．

［10］ 黎同明，朱章志，王桂香．不同配比麻杏甘石湯對哮喘大鼠Th1／Th2類細胞因子分泌的影響［J］．遼寧中醫(yī)藥大學學報，2011，13（8）：200－203．

［11］ 忻悅，呂進泉，呂劍平，等．銀杏葉片聯(lián)合布地奈德吸入治療對哮喘兒童輔助性T細胞亞群的調(diào)節(jié)作用［J］．江蘇大學學報：醫(yī)學版，2009，19（4）：337－338，344．

［12］ 唐丹，梁萍，蘇培媛．支氣管哮喘患兒Th1／Th2細胞免疫平衡變化研究［J］．中國醫(yī)藥科學，2011，1（10）：43－44．

Effect of Kecuan granule on Th1／Th2 cells in peripheral blood from children w ith hot asthma

WANG Hai-sheng1，WANGWu-qiang2，LIU Xiao-lin1，XUE Jian-hua1，WU Yu-fang1，MAMei-xiang1
（1．Department of Clinical Laboratory，2．Departmentof Chinese Pediatrics，Wujin Hospital of Traditional Chinese Medicine，Changzhou Jiangsu 213161，China）

Objective：To explore the effect of Kecuan granule on Th1／Th2 cells in peripheral blood from children with hot asthma．M ethods：Forty-eight children with hot asthma were randomly divided into granule group and routine group，24 cases in each group．The granule group

the administration of kecuan granule，three times per day，1 course of 3-d treatment，for 2 courses；and the routine group received the administration of routine western medicine，pulmicort turbuhaler，10μg／inhaling，and terbutaline sulfate aerosol，0．25mg／spray，twice per day，for one week．Additionally，20 healthy children served as controls．ThemRNA levels of T-box expressed in T cells（T-bet）and GATA binding-3（GATA-3）in human peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were detected by quantitative real-time PCR and the levels of interferon-γ（IFN-γ）and IL-4 in plasmawere detected by ELISA．Results：Total effective rates of the granule group and routine group were 95．83%and 91．67%，respectively，showed no significant differences（χ2＝0．559，P＞0．05）．Before treament，the levels of GATA-3 mRNA and IL-4 in the granule group and routine group were notablely higher than those in the control group（P＜0．01），and there were no significant differences in the levels of T-betmRNA and IFN-γamong the three groups（P＞0．05），but the ratios of T-betmRNA／GATA-3mRNA and IFN-γ／IL-4 in the granule group and routine group were sig-nificantly lower than those in the control group（P＜0．01）．After treatment，there were no significant differences in the levels of T-betmRNA，GATA-3 mRNA，IL-4，IFN-γand the ratios of T-betmRNA／GATA-3 mRNA and IFN-γ／IL-4 among the three groups（P＞0．05），but in the granule group and routine group，the levels of GATA-3 mRNA and IL-4 weremarkedly lower than before treatment（P＜0．01），the ratios of T-betmRNA／GATA-3 mRNA and IFN-γ／IL-4 were notably higher（P＜0．01），and the levels of T-betmRNA and IFN-γwere only slightly higher than those before treatment（P＞0．05）．Conclusion：Children with hotasthma showed Th2 accentuation and the imbalance of Th1／Th2，which could be cured by kecuan granule through inhibiting Th2 cells and correcting the imbalance of Th1／Th2．

kecuan granule；hot asthma；children；Th1 cell；Th2 cell

R725．7；R289．54

A

1671－7783（2014）05－0408－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140071

江蘇省常州市武進區(qū)科技項目（WS201231）

王海生（1971—），男，江蘇揚州人，碩士，副主任技師，主要從事免疫調(diào)節(jié)方面的研究。

2014－03－20 ［編輯］ 劉星星