骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于急性肺損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

徐 瑩 田 野 趙 平

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)骨科，沈陽(yáng)110004）

急性肺損傷、間質(zhì)性肺疾病，臨床表現(xiàn)為呼吸困難，肺彌散功能減低，低氧血癥，X線表現(xiàn)為彌漫性陰影。目前臨床上缺乏有效的治療及阻止病程進(jìn)展的良好方法，因而是一種病死率很高的難治性疾病。在藥物治療的基礎(chǔ)上，近年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞的治療逐漸成為熱點(diǎn)。因?yàn)榉闻K原位干細(xì)胞數(shù)量較少，且其表型特征和龕位分布很難發(fā)現(xiàn)，同時(shí)肺臟的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，所以目前有關(guān)肺臟干細(xì)胞的研究進(jìn)展緩慢。但現(xiàn)在已有報(bào)道，成體組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢至肺臟并長(zhǎng)期定植，通過(guò)對(duì)定植于肺部的成體組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)特異性I型肺泡上皮細(xì)胞的標(biāo)志，包括水通道蛋白—5等的檢測(cè)，也證實(shí)了其它干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肺組織細(xì)胞的可能性。最近的研究提示，在骨髓組織中存在一種多能基質(zhì)干細(xì)胞，具備向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等分化的能力，其生物學(xué)性狀穩(wěn)定，可長(zhǎng)期增殖，這種細(xì)胞有可能成為干細(xì)胞治療的種子細(xì)胞來(lái)源。林群等將轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）經(jīng)頸內(nèi)靜脈注入大鼠體內(nèi)，經(jīng)檢測(cè)后證實(shí)其具有較好的肺內(nèi)靶向性。本研究目的在于，通過(guò)對(duì)成體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷肺部的分布和定植情況的研究，以期對(duì)急性肺損傷、間質(zhì)性肺疾病等難治性肺部疾病的治療提供新思路。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

清潔級(jí)wistar大鼠，4－6周齡，體重150－200克，雌雄不限（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；Percoll分 離 液 （Pharmacia 公 司）；CD29、CD44、CD34、CD45兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德公司）；FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢博士德公司）；脂多糖（sigma公司）；蘇木素（西塔化學(xué)試劑公司）；伊紅（西塔化學(xué)試劑公司）；二甲苯（西塔化學(xué)試劑公司）；無(wú)水酒精（西塔化學(xué)試劑公司）；中性樹(shù)膠（西塔化學(xué)試劑公司）；鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體（中杉金橋公司）；免疫組化試劑盒（中杉金橋公司）。

2.方法

2.1 BMSCs的體外分離和培養(yǎng)

選用6周齡健康Wister大鼠（約150克），頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下分離股骨脛骨，咬去骨兩端，用10ml L－DMEM培養(yǎng)基（無(wú)血清），沖出骨髓于離心管中，吹打制成細(xì)胞懸液。1000 rpm／min，離心10 min，棄上清，再加入10ml L－DMEM培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液，同樣方法離心，棄上清。用LDMEM 3m L重懸細(xì)胞，將懸液貼壁輕輕加入到預(yù)置等體積Percoll分離液（1.073g／m L）的離心管中，2500rpm／min，離心25min。收集云霧狀白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，用L－DMEM洗滌兩次（1000rpm／min，離心5min），用 L－DMEM 培養(yǎng)基（含 15%FBS、100U／ml青、鏈霉素）重懸。接種后24時(shí)首次換液，以后每3天換液，8－12天達(dá)到80－90%融合時(shí)消化傳代。

2.2 BMSCs的鑒定

將BMSCs培養(yǎng)至2代后，取2代細(xì)胞，以2×104傳代于24孔板中，加500μl培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞70%－80%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。取8孔細(xì)胞，去除培養(yǎng)液后PBS清洗3遍，濾紙吸干表面液體，加入500μl 4%的多聚甲醛固定10 min。10min后PBS清洗3遍，濾紙吸干表面液體，分別向8孔內(nèi)滴加CD29、CD44、CD34、CD45兔抗大鼠多克隆抗體（1∶100）300μl，4℃孵育過(guò)夜，次日棄去一抗，PBS清洗3遍后向每孔加入300μl山羊抗兔FITC標(biāo)記的二抗（1∶100），室溫孵育2h后棄去二抗，PBS清洗3遍，濾紙吸干表面液體，熒光顯微鏡下觀察并照相。

2.3 急性肺損傷大鼠動(dòng)物模型建立及分組

20只大鼠隨機(jī)分為兩組：A組 肺損傷組（只注射脂多糖）；B組 肺損傷后干細(xì)胞修復(fù)組（注射脂多糖和干細(xì)胞）。脂多糖以注射用水稀釋成0.5mg／ml，按照2mg／kg經(jīng)大鼠尾靜脈注入；取培養(yǎng)第2代骨髓干細(xì)胞，與溴脫氧尿嘧啶溶液共同培養(yǎng)24h，使溴脫氧尿嘧啶整合于骨髓干細(xì)胞內(nèi)后，以適當(dāng)生理鹽水混合，B組每只大鼠經(jīng)尾靜脈注入0.2ml（含有2.5×106個(gè)細(xì)胞）；另有2只大鼠：1只為正常對(duì)照，不注射任何試劑；1只為干細(xì)胞對(duì)照，只注射干細(xì)胞。觀察比較大鼠呼吸狀態(tài)，呼吸頻率，活動(dòng)狀態(tài)，攝食情況，口鼻分泌物情況。于第5日指標(biāo)觀察后，放血法處死大鼠，取肺組織觀察比較。

2.4 肺組織病理切片制備和觀察

以10%福爾馬林溶液浸泡大鼠肺組織（肺組織均取自左肺上葉，大小約1×1×1cm3）固定48 h，進(jìn)行脫水處理。脫水時(shí)間分別為：75%酒精缸，80%酒精缸，90%酒精缸，95%酒精缸，100%酒精Ⅰ缸，100%酒精Ⅱ缸，時(shí)間分別為1h；二甲苯Ⅰ缸，二甲苯Ⅱ缸，兩個(gè)缸一起為1 h，然后分別經(jīng)浸蠟Ⅰ缸和浸蠟Ⅱ缸各浸蠟1 h，將標(biāo)本變?yōu)橄瀴K；將標(biāo)本蠟塊經(jīng)切片機(jī)切成4 mm后的病理標(biāo)本片，于38℃經(jīng)展片機(jī)展片，于70℃經(jīng)烤片機(jī)烤片4 h；再分別經(jīng)二甲苯Ⅰ缸4 min，二甲苯Ⅱ缸4 min，二甲苯缸Ⅲ4分鐘，100%酒精Ⅰ缸，100%酒精Ⅱ缸，95%酒精缸，75%酒精缸，脫蠟數(shù)秒。

2.5 HE染色和免疫組化染色

HE染色：先將脫蠟的切片經(jīng)蘇木素染色5 min，反蘭3 min鐘，經(jīng)1%鹽水酒精浸泡30 s，伊紅染色7 min，自來(lái)水沖洗；分別經(jīng)70%酒精缸3 s，90%酒精缸3 s，100%酒精Ⅰ缸4 min，100%酒精Ⅱ缸4 min，二甲苯Ⅰ缸4 min，二甲苯Ⅱ缸4 min，進(jìn)行脫色處理；用中性樹(shù)膠封片。

免疫組織化學(xué)染色：蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min鐘；3%H2O2去離子水孵育5－10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育10－15 min，傾去；滴加適當(dāng)比例稀釋的鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體，37℃孵育2－3 min或4℃過(guò)夜；PBS沖洗，3 min×3次；滴加生物素化二抗工作液，室溫或37℃孵育10－15 min；PBS沖洗，3 min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫或37℃孵育10－15 min；PBS沖洗，3分鐘×3次；顯色劑顯色；自來(lái)水充分沖洗；用中性樹(shù)膠封片。

以O(shè)lympus光學(xué)顯微鏡分別于低倍鏡（×10）和高倍鏡（×40）下，觀察比較大鼠肺組織病理切片。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1.大鼠BMSCs培養(yǎng)形態(tài)觀察結(jié)果

原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后可見(jiàn)到細(xì)胞多數(shù)呈小圓形，少量貼壁且伸出突起的細(xì)胞，呈小的短梭形或三角形。第3d起伸出突起細(xì)胞增多，呈集落多細(xì)胞性分布，可見(jiàn)分裂相。4、5天開(kāi)始形成分布均勻的團(tuán)簇狀增生灶，且數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)呈較大的長(zhǎng)梭形，排列較緊密，培養(yǎng)的第5天即可見(jiàn)散在的細(xì)胞群落形成；第9－10天細(xì)胞生長(zhǎng)即可達(dá)80%－90%的融合，呈很大的長(zhǎng)梭形，緊密排列可有旋渦狀形成。第2代后細(xì)胞的形態(tài)比較均一（圖1）。

3.指標(biāo)觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果

正常對(duì)照和干細(xì)胞對(duì)照大鼠呼吸狀態(tài)及活動(dòng)性良好。A、B兩組均有部分大鼠呼吸困難，呼吸頻率加快，不活動(dòng)和不進(jìn)食，口鼻有粉紅色分泌物。但A組數(shù)量更多，呼吸頻率加快更明顯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1、2）。A組有4只大鼠于處死前死亡，其中1只為注射后立即死亡，故未列入統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)。

4.大鼠肺組織病理觀察結(jié)果

大體觀察：正常對(duì)照和干細(xì)胞對(duì)照大鼠肺臟無(wú)異常。A、B兩組大鼠肺臟均出現(xiàn)不同程度淤血水腫，但A組程度更重，且有3只大鼠肺臟出現(xiàn)了肉眼可見(jiàn)的實(shí)變改變。

HE染色：正常對(duì)照和干細(xì)胞對(duì)照大鼠肺病理切片顯示，肺組織無(wú)損傷出現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)正常（圖3）A組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織明顯水腫充血，部分肺泡腔內(nèi)滲出、充血、肺泡萎陷不張；肺泡間隔增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，部分肺臟出現(xiàn)實(shí)變的情況（圖3）；B組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織也出現(xiàn)了水腫和充血情況，部分肺泡腔內(nèi)也有滲出、充血、肺泡萎陷，但較A組為輕，且無(wú)肺實(shí)變情況發(fā)生（圖3）。

表1 兩組大鼠觀察指標(biāo)比較Table 1 Observation index of two groups

表2 兩組大鼠呼吸頻率比較（次／分）Table 2 Respiratory rates of two groups（beat／min）

圖1 原代培養(yǎng)的BMSCs（a）和第2代培養(yǎng)的BMSCs（b）（×10）Fig.1 Primary BMSCs（a）and BMSCs of second generation（b）（×10）

圖3 正常對(duì)照（a）、干細(xì)胞對(duì)照（b）、肺損傷組（c－k）和干細(xì)胞修復(fù)組（l－u）大鼠肺臟病理 HE染色（×10）Fig.3 Lungs pathology of control（a），stem cell control（b），A group（c－k）and B group（l－u）HE staining（×10）

圖2 免疫熒光法檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物結(jié)果Fig.2 BMSCs surface markers detection by immunofluorescence

圖4 正常對(duì)照（a）、干細(xì)胞對(duì)照（b）、肺損傷組（c）和干細(xì)胞修復(fù)組（d）肺臟病理 免疫組化（×40）Fig.4 Lungs pathology of control（a），stem cell control（b），A group（c）and B group（d）immunohistochemistry（×40）

2.大鼠BMSCs的鑒定

免疫熒光法檢測(cè)BMSCs CD29、CD44呈陽(yáng)性反應(yīng)，CD34、CD45呈陰性反應(yīng)（圖2）。

免疫組化染色：正常對(duì)照和干細(xì)胞對(duì)照大鼠肺病理切片顯示，肺組織無(wú)損傷出現(xiàn)，于干細(xì)胞對(duì)照大鼠肺病理切片可發(fā)現(xiàn)呈長(zhǎng)圓形或梭形較大細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒（圖4），表明骨髓干細(xì)胞確于肺內(nèi)定植；A組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織內(nèi)無(wú)細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒細(xì)胞（圖4）；B組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)呈長(zhǎng)圓形或梭形較大細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒（圖4），表明骨髓干細(xì)胞確于肺內(nèi)定植。

討 論

BMSCs是多分化潛能的干細(xì)胞，在一定誘導(dǎo)條件下，可以形成骨、軟骨或脂肪等組織，因此是組織工程的種子細(xì)胞［1，2］，目前是研究的熱點(diǎn)。到目前為止，BMSCs的培養(yǎng)和分離方法有很多種，比較常用的方法是密度梯度離心法［3］、貼壁細(xì)胞分離法、流式細(xì)胞儀法［4］和免疫磁珠分離法［5］。作為組織工程的種子細(xì)胞，細(xì)胞的純度越高越能符合組織工程研究的要求，實(shí)驗(yàn)中我們把密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，用比重為1.073 g／ml的percoll分離液分離骨髓MSCs，隨換液棄除血細(xì)胞。具有操作簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，禰補(bǔ)了流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離法影響細(xì)胞活性，單純貼壁法所得的BMSCs的純度不足的缺點(diǎn)，是一種比較理想的分離純化方法。

近期研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs還沒(méi)有一種特異的表面標(biāo)記，故無(wú)法直接鑒定，本實(shí)驗(yàn)中我們采用免疫熒光法進(jìn)行鑒定，CD29、CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD45表達(dá)陰性，與文獻(xiàn)相符合［6］。說(shuō)明分離的細(xì)胞純度較高，成份比較單一，不是造血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，而是BMSCs。

目前大鼠肺損傷動(dòng)物模型的建立有很多種方法，如經(jīng)137銫照射300cGy，注射油酸或博來(lái)霉素等。本研究采用脂多糖經(jīng)大鼠尾靜脈注入的方法，按照2mg／kg給藥，除A組1只大鼠于給藥后立即死亡外，其余大鼠均存活數(shù)日，處死后其肺組織病理切片均出現(xiàn)肺部水腫充血及部分實(shí)變情況，說(shuō)明脂多糖可以造成大鼠急性肺損傷。

急性肺損傷起病急，發(fā)展迅速，病情兇險(xiǎn)，治療困難。治療急性肺損傷的方法目前臨床上有很多種，但各種方法均有其不足之處，且對(duì)于急性肺損傷的治療效果非常有限，因而急性肺損傷是一種病死率很高的難治性疾病。在藥物治療的基礎(chǔ)上，近年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞的治療逐漸成為熱點(diǎn)。因?yàn)榉闻K原位干細(xì)胞數(shù)量較少，且其表型特征和龕位分布很難發(fā)現(xiàn)，同時(shí)肺臟的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，所以目前有關(guān)肺臟干細(xì)胞的研究進(jìn)展緩慢［7］。但現(xiàn)在已有報(bào)道，成體組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢至肺臟并長(zhǎng)期定植［8］，通過(guò)對(duì)定植于肺部的成體組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)特異性I型肺泡上皮細(xì)胞的標(biāo)志，包括水通道蛋白—5等的檢測(cè)，也證實(shí)了其它干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肺組織細(xì)胞的可能性［9］。本研究經(jīng)大鼠尾靜脈注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，經(jīng)肺病理切片免疫組化檢查證實(shí)干細(xì)胞確于肺內(nèi)歸巢定植，且其對(duì)急性肺損傷確有修復(fù)保護(hù)作用。由于干細(xì)胞具有自我更新及多向分化能力，且具有取材容易，細(xì)胞增殖快速，生物學(xué)性狀穩(wěn)定，便于自體移植等特點(diǎn)，近年來(lái)在基因治療肺損傷中倍受重視［10，11］。目前有研究表明，BMSCs對(duì)于矽肺大鼠模型肺臟的損傷和纖維化，具有明顯的抑制作用［12］；通過(guò)對(duì)高氧所致新生大鼠肺損傷的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以明顯抑制損傷肺臟的炎癥反應(yīng)，從而減輕高氧所致的肺損傷程度［13］，但是其具體機(jī)制目前還不完全清楚。隨著基因治療肺部疾患研究的不斷深入，相信干細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療有望成為治療急性肺損傷的有效方法之一。

本研究存在的缺點(diǎn)和有待于研究的問(wèn)題：①不同代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的肺內(nèi)歸巢活性是否相同［14］，如何檢查；②不同劑量脂多糖對(duì)大鼠肺損傷的程度有多大影響；③骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大鼠肺內(nèi)定植期有多長(zhǎng)，其影響因素是什么［15］。④由于本研究樣本量較小，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性肺損傷大鼠肺臟的修復(fù)保護(hù)作用，其確切性和具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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