4種萜類化合物對蝴蝶蘭莖腐病菌的抑制作用及機理的初步研究

丁 蘭， 何 苗， 王保強， 劉國安

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

4種萜類化合物對蝴蝶蘭莖腐病菌的抑制作用及機理的初步研究

丁 蘭*， 何 苗， 王保強， 劉國安

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

摘要以從蝴蝶蘭莖腐病斑分離的12株革蘭氏陰性菌和2株真菌為試驗材料，研究香茶菜屬植物中2種二萜（leukamenin E和weisiensin B）以及2種三萜（熊果酸和2-α-羥基熊果酸）的抑菌活性，并對leukamenin E抑制病原菌尖鐮孢生長的機理進行初步研究。結(jié)果表明，leukamenin E對2株真菌的抑制作用最強，熊果酸和2-α-羥基熊果酸次之，weisiensin B最弱；800μmol／L leukamenin E可破壞尖鐮孢菌絲體細胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)，并使菌絲細胞膜通透性顯著增加，導致菌絲體極性生長受阻。4種萜類對12株細菌的抑制活性顯示了明顯的選擇性和互補特性，leukamenin E對其中5種細菌有抑制作用，而weisiensin B則對其他4種細菌具有抑制活性，weisiensin B還對2種三萜均無抑制效應的細菌也有較強的抑制活性，揭示了香茶菜植物萜類分子結(jié)構(gòu)多樣性具有重要的化學生態(tài)學意義。

關鍵詞對映-貝殼杉烷二萜； 烏蘇烷型三萜； 蝴蝶蘭莖腐?。?尖鐮孢； 抑菌活性

香茶菜屬植物在我國共有90種、25變種，植物資源非常豐富。該屬植物除了具有良好的抗腫瘤作用之外［1］還顯示了對30余種人致病細菌具有較強的抑制作用［2-4］，以提取物為主要成分的消炎利喉藥用品已上市出售；不僅如此，顯脈香茶菜和藍萼香茶菜的莖葉提取物對多種植物病原菌也有較強的抑制活性［5-7］，其中從顯脈香茶菜分離得到的6種對映-貝殼杉烷二萜均對黃瓜疫霉菌具有極顯著的抑制作用［5］，這顯示了進一步研究開發(fā)植物源農(nóng)藥的價值和潛力。研究證實，對映-貝殼杉烷二萜及三萜化合物是香茶菜屬植物的主要次生代謝產(chǎn)物［8-9］，迄今從該屬植物中已發(fā)現(xiàn)該類二萜500多種［8］，三萜10余種［9］。本課題組對多種香茶菜屬植物的化學成分進行了系統(tǒng)研究［10-12］，盡管每種香茶菜中含有約10余種萜類化合物，但僅有1種二萜和2種三萜（熊果酸和2-α-羥基熊果酸）在含量上占絕對優(yōu)勢，這3種化合物的總含量占分離化合物的90%以上，測定這些高含量萜類抑制植物病原菌的能力是確定提取物中的有效成分及植物農(nóng)藥質(zhì)量控制的重要基礎。

花卉、蔬菜等在保護地種植具有高密度及高溫、高濕的環(huán)境特點，極易發(fā)生病害，常年高頻率使用各種化學合成農(nóng)藥已成為無奈之舉［13］。尤其是溫室的高溫和密閉性，使噴霧的農(nóng)藥難以消散，對從業(yè)人員健康傷害大；同時，大量農(nóng)藥殘余也會給土壤、水體等生態(tài)環(huán)境帶來嚴重污染。亟待研究開發(fā)環(huán)境友好型植物源農(nóng)藥。蝴蝶蘭的產(chǎn)業(yè)化種植過程中由于種植密度高，苗期生長環(huán)境溫度高、濕度大，因此真菌［14-15］、細菌［16］和病毒［17］危害嚴重，給蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，大量使用的化學合成農(nóng)藥有五氯硝基苯、福美雙及敵磺鈉等［18］。本研究選擇蝴蝶蘭莖腐病為受試對象，從蝴蝶蘭莖腐病灶分離感染細菌和真菌，以它們?yōu)槭茉嚲辏芯扛拭C產(chǎn)總序香茶菜和維西香茶菜中2種對映-貝殼杉烷二萜和2種三萜的抑菌能力，并探索高活性化合物的抑菌機制，為防治蝴蝶蘭莖腐病的植物源農(nóng)藥的研制提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

分離自蝴蝶蘭莖腐植株的細菌和真菌。

1.1.2 供試藥物

對映-貝殼杉烷二萜：leukamenin E和weisiensin B；烏蘇烷型三萜：熊果酸（ursolic acid）和2-α-羥基熊果酸（2-α-hydroxy ursolic acid），均由本實驗室從甘肅產(chǎn)總序香茶菜［Rabdosia racemosa（Hemsl.）Hara］和維西香茶菜（Rabdosia weisiensis C.Y.Wu）中分離得到［19-20］，純度達99%以上。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝴蝶蘭莖腐病原菌的分離與鑒定

病原細菌采用畫線分離法［21］。選擇蝴蝶蘭莖腐植株，切留病斑莖段，流水沖洗后用75%乙醇浸泡1 min，再用0.1%升汞表面消毒8 min，無菌水換洗3次后將組織研碎，無菌水浸泡60 min，使細菌釋放至水中。用接種環(huán)蘸取浸泡液在細菌培養(yǎng)基平板表面畫線，于（27±1）℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑出單個菌落再畫線培養(yǎng)，如此反復多次，得純化菌落。觀察各菌落形態(tài)并進行革蘭氏染色［21］。

病原真菌的分離采用組織分離法［22］。用解剖刀從蝴蝶蘭莖腐莖段的病斑邊緣（病健交界處）切塊（0.5 cm×0.5 cm），表面消毒后（見上述細菌分離的消毒法），移至孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，用接種針挑取尖端菌絲于新培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，若無雜菌生長，即得病菌純菌種。

真菌形態(tài)特征觀察采用插片法［21］。用無菌鑷子取無菌蓋玻片，以45度角插于真菌培養(yǎng)基平板上，從試管斜面挑取少量孢子接種于蓋玻片與培養(yǎng)基交界處，待長出菌絲后將蓋玻片于顯微鏡下觀察菌絲體和孢子的形態(tài)。按照魏景超［23］和中國科學院微生物研究所《常見與常用真菌》的分類特征［24］比較鑒定。

1.2.2 蝴蝶蘭莖腐病原菌的確定

將出瓶生長6個月的健康蝴蝶蘭幼苗用作回接試驗材料。75%乙醇將幼苗莖部表面消毒后用無菌水沖洗，無菌條件下用滅菌針刺傷莖的基部表皮1～2 mm，用1.2.1中分離純化的真菌進行接種［15］，每組3株苗，2組重復。置于28℃氣候箱中培養(yǎng)并觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.3 4種萜類化合物的抑菌活性測定

1.2.3.1 對蝴蝶蘭莖腐病分離細菌的抑制作用

采用麥氏濁度法確定菌懸液濃度［25］，將制備好的菌懸液搖勻后，取100μL加到已制好的平板上，用無菌玻璃棒涂布均勻，再用無菌鑷子取直徑為6 mm的滅菌濾紙片浸于不同濃度的藥液中至其浸潤飽和，將含藥濾紙片貼在平板上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用十字交叉法測定抑菌圈大小，抑菌圈直徑小于10 mm為不敏感，抑菌圈直徑10～15 mm為中度敏感，抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感。3次獨立試驗。

1.2.3.2 對蝴蝶蘭莖腐病原菌的抑制作用

將高壓滅菌后的真菌培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時加入藥物母液（對照加0.5 m L無菌水），搖勻，制成不同濃度含藥平板。用打孔器沿已活化的真菌平板邊緣打制直徑6 mm的菌餅，將菌餅接種在含藥平板中央，每皿一塊，每處理3個重復，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，用十字交叉法測菌落直徑（測量值－6 mm），計算相對抑菌率。

相對抑菌率（%）＝［（對照組菌落直徑－藥物組菌落直徑）／對照組菌落直徑］×100。

1.2.4 leukamenin E抑菌機理的初步研究

1.2.4.1 leukamenin E對尖鐮孢形態(tài)及微絲的影響

參照Gupta的方法［26］，略有改動。將平板邊緣生長有菌絲的瓊脂培養(yǎng)基切成條狀小塊，接種到覆蓋于OM培養(yǎng)基［27］表面的透析膜（1.0 cm× 3.5 cm）上，28℃下生長約2 d后，將長有菌絲的透析膜剪下，置于含有800μmol／L leukamenin E的OM液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取培養(yǎng)2、3和5 h的部分菌絲于油鏡下觀察拍照；另取培養(yǎng)3 h和5 h的部分菌絲用4%甲醛固定30 min，PEM（p H7.0）緩沖液洗5次，微絲封閉液（0.2%Triton X100和0.1%BSA的PBS溶液）室溫封閉1 h，濾紙吸干，用FITC-Phalloidin染色60 min，PEM洗滌5次，采用Leica DMI 4 000B熒光顯微鏡，油鏡下觀察。以10μg／m L特異性微絲組裝抑制劑——細胞松弛素B（cytochalasin B）處理1 h為陽性對照。

1.2.4.2 leukamenin E對尖鐮孢細胞膜通透性的影響

另外，將已活化的菌絲置于凹玻片上，加100μL 800μmol／L leukamenin E的OM液體培養(yǎng)基，對照組菌絲用等量OM液體培養(yǎng)基，放置于濕盒培養(yǎng)2 h后，用碘化丙錠（PI）染色5 min，在Leica DMI 4 000B熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭莖腐病原菌的分離與鑒定

從蝴蝶蘭莖腐植株病斑處分離得到12株疑似感染細菌X1～X12，菌落基本形態(tài)見表1。所分離到的大部分細菌菌落較小，表面濕潤，邊緣整齊，而其隆起程度和顏色差異較大；通過革蘭氏染色鑒定，12株細菌都是革蘭氏陰性菌，且均為桿菌。

表1 從蝴蝶蘭莖腐病分離細菌的菌落形態(tài)Table 1 The colonial morphology of bacteria separated from Phalaenopsis amabilis stem rot

從蝴蝶蘭莖腐病植株上共分離出2株疑似病原真菌（見圖1）。采用插片法，觀察了它們的菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子的形態(tài)。圖1中a，c分別為M1和M2的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；b，d分別為M1和M2的孢子形態(tài)。經(jīng)形態(tài)學鑒定，M1和M2均為半知菌類，叢梗孢目，瘤座孢科鮮色多孢族，鐮孢屬。M1菌落絨狀，表面呈粉白色、淺粉色，菌落中央略顯紫色，反面菌落中心呈暗紫色；M2菌落薄絨狀，淺紫色，有白色氣生菌絲區(qū)，反面菌落中央呈土色。其中M1初步鑒定為尖鐮孢（Fusarium oxysporum），M2初步鑒定為腐皮鐮孢（Fusarium solani）。

多篇文獻報道蝴蝶蘭莖腐病原菌為真菌［14-15］，因此本試驗將上述分離得到的2株真菌進行回接試驗，結(jié)果表明，尖鐮孢可引起蝴蝶蘭莖腐病。

2.2 4種萜類化合物的抑菌活性測試

2.2.1 對從蝴蝶蘭莖腐病斑分離細菌的抑制作用

4種萜類對分離得到的細菌的抑菌活性見表2。在藥物濃度為4 mmol／L條件下，4種萜類顯示了不同的抑菌活性。2種三萜化合物比2種二萜化合物具有更廣譜的抗革蘭氏陰性菌的能力；2種三萜相比，熊果酸的抗菌能力高于2-α-羥基熊果酸，熊果酸對10種細菌有抑菌作用，其中4株菌對熊果酸中度敏感，而2-α-羥基熊果酸僅對7種細菌有抑制活性，其抑菌圈均小于10 mm。2種二萜中weisiensin B抗菌性稍強于leukamenin E，12株細菌中有4株對weisiensin B顯示了中度或高度敏感，僅2株對leukamenin E顯示了高度敏感。

圖1 從蝴蝶蘭莖腐病斑分離真菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)Fig.1 The morphology of sporulation structures and spores of the fungi separated from Phalaenopsis amabilis stem rot

非常有趣的現(xiàn)象是，4種萜類對10種革蘭氏陰性菌的抑制活性顯示了選擇性和互補性。二萜weisiensin B對4種細菌X1、X3、X5和X11顯示了較強的抑制作用，但leukamenin E卻對另外5種細菌X2、X6、X7、X9和X10有抑制作用；2-α-羥基熊果酸對X4、X7和X8沒有抑制作用，但熊果酸對其卻有一定的抑制效應。同樣，二萜和三萜之間也顯示了抑菌互補性，2種三萜對X3和X11均沒有抑制作用，但二萜weisiensin B卻對它們顯示了較強的抑制活性。

表2 4種萜類化合物對從蝴蝶蘭莖腐病斑分離細菌的抑制作用1）Table 2 The antibacterial effects of four terpenoids on the bacteria separated from Phalaenopsis amabilis stem rot

2.2.2 4種萜類化合物對蝴蝶蘭莖腐病菌的抑制作用

4種萜類化合物對2株真菌的抑制活性見表3。4種萜類的抑菌活性有較大差異，二萜leukamenin E對受試2種真菌的抑制作用最強，400μmol／L時的抑制率分別為為50.5%和66.5%。熊果酸和2-α-羥基熊果酸次之，weisiensin B最弱。

2.3 leukamenin E抑制尖鐮孢生長的機理

2.3.1 對尖鐮孢形態(tài)及微絲的影響

800μmol／L leukamenin E處理尖鐮孢菌絲2～5 h后，菌絲形態(tài)如圖2a～d所示。對照組菌絲光滑，粗細一致，原生質(zhì)體均勻透亮；處理組在2 h時菌絲尖端開始膨大形成囊泡狀；3 h時菌絲折光性降低，變得粗糙，原生質(zhì)開始出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，在距菌絲頂端囊泡下2～3μm處出現(xiàn)分叉狀，菌絲變細扭 曲（圖2c）；5 h時少量菌絲尖端形成空泡（圖2d）。

表3 4種萜類化合物對從蝴蝶蘭莖腐病斑分離真菌的相對抑制率（3 d）Table 3 The relative inhibition rates of the four terpenoids against the fungi separated from Phalaenopsis amabilis stem rot（3 d）

熒光染料FITC標記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）常被用于細胞骨架微絲蛋白的染色。它對細胞染色的結(jié)果見圖2g～j，對照組菌絲體熒光分布均勻，表明菌絲體細胞內(nèi)微絲均勻分布于胞質(zhì)內(nèi)（圖2g）；800μmol／L leukamenin E處理組菌絲體內(nèi)的微絲熒光形成截斷，表明細胞內(nèi)絲狀微絲斷裂（圖2h～i）。與陽性對照細胞松弛素B處理組出現(xiàn)的斷裂現(xiàn)象（圖2j）類似，進一步證實，leukamenin E可通過損傷菌絲體細胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)影響尖鐮孢的生長。

2.3.2 碘化丙錠染色觀察二萜leukamenin E對尖鐮孢細胞膜通透性的影響

熒光染料碘化丙錠（PI）可與核酸特異結(jié)合，在450～490 nm激發(fā)光照射下會發(fā)射出波長520 nm左右的紅色熒光。由于PI本身不能透過生物膜，熒光顯微鏡下僅能觀察到對照組菌絲體極微弱的紅色熒光；隨著細胞膜通透性增大，菌絲體紅色熒光也隨之增強。從圖2e～f可以看出，對照組菌絲幾乎不被PI染色，但800μmol／L的leukamenin E處理2 h時絕大部分尖鐮孢菌絲被染成紅色，說明處理組菌絲體細胞膜結(jié)構(gòu)受到較大損傷，從而極大地改變了其通透性。

3 討論

植物病原菌對植物組織的侵染經(jīng)歷了侵入、菌大量繁殖、寄主細胞結(jié)構(gòu)損傷到壞死的復雜過程。同時，環(huán)境中的弱致病菌會因細胞結(jié)構(gòu)的破壞形成次級感染，加速病情發(fā)展［28］。因此，對于植物病害的防治除了對植物病原菌進行殺滅之外，對引起次級感染的病菌最好也有抑制作用。

本文從蝴蝶蘭莖腐病斑分離得到12株細菌和2株真菌（其中1株為病原菌），測試了來源于甘肅產(chǎn)總序香茶菜和維西香茶菜的4種萜類化合物對它們的抑制活性。2種二萜leukamenin E與weisiensin B具有相似的分子結(jié)構(gòu)，兩者同為C-20未氧化型對映-貝殼杉烷二萜，不同之處僅在于前者的C-3有一個乙?；?，而后者的C-18有一個醛基［19-20］；2種烏蘇烷型三萜熊果酸與2-α-羥基熊果酸也具有極為相似的分子結(jié)構(gòu)，不同之處僅在于后者的C-2位多一個羥基取代基。上述4種化合物顯示了完全不同的抑菌效應。它們對2株真菌的抑制強弱順序為leukamenin E＞熊果酸和2-α-羥基熊果酸＞weisiensin B；4種萜類對12種革蘭氏陰性菌的抑制作用顯示了明顯的選擇性和互補性特點（表2），leukamenin E完全不能抑制生長的細菌，對weisiensin B很敏感；三萜完全不能抑制生長的細菌，二萜的抑制活性很好。由此可知，香茶菜屬植物中的二萜和三萜分子結(jié)構(gòu)的多樣性形成了抗菌能力的多樣性，揭示了植物次生代謝產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)多樣性的化學生態(tài)學意義，也明示了植物源農(nóng)藥的開發(fā)利用盡可能以使用復方途徑為佳。

本文的回接試驗顯示蝴蝶蘭莖腐病原菌為尖鐮孢（Fusarium oxysporum），這與多篇文獻報道［14，18］相一致。近年來，利用植物提取物防治尖鐮孢病害已越來越受到關注［29］，苦檻藍、石菖蒲提取物及某些藥用植物的混配物對尖鐮孢顯示了較強的抑制作用［30-32］。4種萜類中二萜leukamenin E對尖鐮孢的抑制活性最強，進一步研究發(fā)現(xiàn)，測試濃度下該化合物可破壞尖鐮孢菌絲體細胞內(nèi)微絲，并使細胞膜通透性顯著增加。真菌菌絲的生長是基于細胞骨架的菌絲頂部極化的胞吐作用和胞質(zhì)膨壓，將胞質(zhì)推向柔韌的頂端細胞壁［33］，而菌絲頂端的微絲骨架系統(tǒng)主導了細胞質(zhì)的向頂運動和細胞壁泡囊的分泌和運輸過程［34］。因此，二萜leukamenin E對微絲正常結(jié)構(gòu)的破壞中斷了菌絲細胞生長物質(zhì)運輸載體——泡囊的向頂運輸，這是導致尖鐮孢菌絲形態(tài)改變和生長受阻的直接原因。至于菌絲細胞膜的通透性改變是否與微絲受損直接相關還有待進一步研究證實。

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中圖分類號：S 436.81

文獻標識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.007

收稿日期：2013-10-14

修訂日期：2014-01-03

基金項目：西北師范大學知識與科技創(chuàng)新工程項目（NWNU-KJCXGC-03-65）；國家自然科學基金（30960464）

*通信作者E-mail：dinglan＠nwnu.edu.cn

Antibacterial activity and related mechanism of four terpenoids on the pathogen of Phalaenopsis amabilis stem rot

Ding Lan， He Miao， Wang Baoqiang， Liu Guo’an
（College of Life Sciences，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

AbstractIn this study，twelve Gram-negative bacteria and two fungi from Phalaenopsis amabilis stem rot were tested to evaluate the antibacterial activity of the ent-kaurane diterpenoids（leukamenin E and weisiensin B）and the triterpenes（ursolic acid and 2-α-hydroxy ursolic acid）.In addition，the antibacterial activity of leukamenin E to Fusarium oxysporum was preliminarily studied.The results showed that the antibacterial activity of leukamenin E was the strongest to the two fungi，while that of weisiensin B was the weakest and the two triterpenes had moderate activity.Leukamenin E at 800μmol／L could destroy the F-actin cytoskeleton of F.oxysporum，and make the cell membrane of F.oxysporum magnify obviously，resulting in hindered growth of mycelium polarity.The antibacterial activity of the four terpenoids showed obvious characteristics of selectivity and complementarity on twelve bacteria.Leukamenin E had antibacterial activity to five bacteria，while weisiensin B had antibacterial activity to other four bacteria.Weisiensin B had the antibacterial activity to the bacteria that were insensitive to two kinds of triterpenes.The test revealed that the diversity of molecular structure of terpenoids from Isodon plants had important significance in chemical ecology.

Key wordsent-kaurane diterpenoid； ursane triterpense； Phalaenopsis amabilis stem rot； Fusarium oxysporum； antibacterial activity