適用于鐮刀菌基因敲除和熒光融合蛋白表達(dá)的高效通用載體的構(gòu)建

王曉亮， 張 昊， 潘 逸， 許景升， 徐 進(jìn)， 馮 潔

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

絲狀真菌是一類產(chǎn)生繁茂菌絲體不產(chǎn)生子實(shí)體的真菌，廣泛分布于自然界，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有重要作用［1－2]。禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearumSchwabe）等植物病原真菌是絲狀真菌的重要組成部分，由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病 （Fusariumhead blight，F(xiàn)HB）是一種世界范圍內(nèi)的重要病害［3]，近年來在我國發(fā)生尤為嚴(yán)重。該病害的流行除了引起小麥產(chǎn)量損失外，禾谷鐮刀菌還能產(chǎn)生多種毒素，造成食品安全上的巨大隱患［4－6]。

禾谷鐮刀菌的全基因組測(cè)序已于2002年完成，測(cè)序菌株為歐洲和北美發(fā)現(xiàn)的野生型菌株P(guān)H－1，測(cè)序結(jié)果包括基因組序列、遺傳圖譜和表達(dá)序列標(biāo)簽等［7－9]。在此基礎(chǔ)上，采用比較基因組學(xué)、生物信息學(xué)方法對(duì)禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)發(fā)育、致病和毒素合成等分子機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)并取得了較大的進(jìn)展，禾谷鐮刀菌等植物病原絲狀真菌基因組學(xué)的時(shí)代已經(jīng)到來［10]。Wang等系統(tǒng)地對(duì)禾谷鐮刀菌所有116個(gè)蛋白激酶基因進(jìn)行了功能鑒定，獲得了96個(gè)基因的突變體，得到了大量表型數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步明確其參與代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)［11]。Jiang等鑒定了HOG途徑中多個(gè)關(guān)鍵基因的功能，明確了其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制［12－13]。Kimura等闡明了禾谷鐮刀菌中單端孢霉烯族毒素合成的分子調(diào)控機(jī)制［14]。最近，Zhao等利用RNA－Seq技術(shù)對(duì)于禾谷鐮刀菌的基因組的注釋進(jìn)行了修訂，修改了655個(gè)錯(cuò)誤的基因注釋，鑒定了2 459個(gè)轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，確定了7 666個(gè)基因的5′UTR和3′UTR［15]。與此同時(shí)，利用反向遺傳學(xué)方法，直接從基因入手，通過基因敲除和回復(fù)、基因沉默、基因過表達(dá)和對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行定位等來研究基因功能的文章也已經(jīng)十分普遍。王光輝等研究得出小麥赤霉菌中的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)τ诔嗝咕z的正常生長(zhǎng)和致病性都有重要的作用［16]。Min等研究得出，在禾谷鐮刀菌中敲除過氧化物酶體基因PEX5、PEX6和PEX7，影響了碳源營養(yǎng)的利用和致病性［17]。但是，目前對(duì)于基因敲除和回復(fù)、過表達(dá)外源蛋白或熒光融合蛋白，基本上每個(gè)基因還需各自獨(dú)立構(gòu)建載體，缺少通用的載體，耗費(fèi)的時(shí)間精力非常多［1]。在構(gòu)建敲除載體的時(shí)候，兩條同源重組片段需要連接在載體抗性基因的兩側(cè)，這樣就需要使用4種不同的酶切位點(diǎn)、2次成功的轉(zhuǎn)化來保證重組片段的方向性和正確性（圖1）。近些年來，出現(xiàn)了很多依靠不同的限制性內(nèi)切酶消化出特定酶切位點(diǎn)，再將常規(guī)PCR獲得同源重組片段插入到這些位點(diǎn)上的高通量的技術(shù)，包括了Xi克隆法（Xi－cloning）、連 接 酶 克 隆 法 （LIC－PCR）、重 組 克 隆 法（recombinational cloning）以及USER酶克隆技術(shù)（USER friendly cloning techniques）［18－21]。

USER（uracil－specific excision reagent）酶克隆技術(shù)，可以在不使用酶切位點(diǎn)和DNA連接酶的條件下直接將PCR產(chǎn)物克隆到載體。USER酶是一種特異性切割尿嘧啶的混合酶，包含尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和核酸內(nèi)切酶Ⅷ。其中，UDG催化尿嘧啶堿基的切除，形成一個(gè)脫嘧啶位點(diǎn)，但同時(shí)保持了磷酸二酯鍵骨架的完整性。核酸內(nèi)切酶Ⅷ的裂解酶活性則分別在脫堿基位點(diǎn)的3′端 和5′端裂解磷酸二酯鍵骨架，釋放無堿基的脫氧核糖。此方法需在PCR引物5′端加入一段較長(zhǎng)的（8～10bp）包含有脫氧尿嘧啶dU的與載體互補(bǔ)的特異性序列。在USER酶作用下，引物兩側(cè)5′端至dU的序列被剪切，形成具有8～10個(gè)堿基的3′突出黏性末端，同時(shí)在載體上制備與之互補(bǔ)黏性末端，由于黏性末端長(zhǎng)度遠(yuǎn)長(zhǎng)于普通酶切位點(diǎn)，所以不需要DNA連接酶的作用即可完成連接。本研究構(gòu)建了3個(gè)適用于USER酶克隆技術(shù)的通用載體，并通過試驗(yàn)證明這些載體在不需要酶切位點(diǎn)和DNA連接酶的條件下具有很高的連接效率，可用于大規(guī)模構(gòu)建鐮刀菌基因敲除和熒光融合蛋白表達(dá)載體，從而進(jìn)行高通量鐮刀菌基因功能分析。

圖1 基因敲除載體的兩種構(gòu)建方法Fig.1 Two methods for construction of gene replacement vectors

1 材料與方法

1.1 菌株和DNA

試驗(yàn)使用的小麥赤霉病菌株為禾谷鐮刀菌國際標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)H－1。將菌株接種在PDA平板上28℃避光培養(yǎng)5d，刮取菌絲于2mL離心管中，液氮速凍，破碎，采用真菌DNA小量提取試劑盒D3390－02（Omega，美國）提取DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 酶和試劑

USERTM酶，PacI酶，Nt.BbvCI酶（New England Biolabs公司，美國），大腸桿菌（E.coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α（天根生化有限科技公司，北京），寡核苷酸退火緩沖液（碧云天生物技術(shù)研究所），PCR篩選陽性克隆使用PCR MIX（東盛集團(tuán)有限公司，廣州），PRIMERSTAR高保真DNA聚合酶（寶生物公司，大連）所有PCR反應(yīng)以及溫度孵育過程都在Eppendorf Mastercycler gradient（Eppendorf公司，德國）上進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)根據(jù)Broad研究所提供的數(shù)據(jù)以及相關(guān)的注釋（網(wǎng)址：http：∥www.broad.mit.edu／annotation）并通過Prime Premier 5進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物合成和后續(xù)的測(cè)序都由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 載體構(gòu)建

pKH質(zhì)粒和pKN質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。pKH質(zhì)粒是pBluescriptⅡKS質(zhì)粒為基礎(chǔ)，在EcoRⅤ位點(diǎn)插入了潮霉素抗性片段。pKN質(zhì)粒是pBluescriptⅡKS質(zhì)粒為基礎(chǔ)，在XhoⅠ位點(diǎn)插入G418抗性片段。

1.3.1 基因敲除通用載體的構(gòu)建

合成互補(bǔ)的寡核苷酸序列UBamHI和UEcoRI、DXhoI和DKpnI，來構(gòu)建抗性基因兩側(cè)的USER酶克隆位點(diǎn)（USER cloning sites，UCS）。100μL退火體系：UBamHI（DXhoI）10μmol／L、UEcoRI（DKpnI）10μmol／L、退火緩沖液1×；退火程序：95℃5min，每8s下降0.1℃，降至25℃，4℃保溫，使兩條寡核苷酸序列形成雙鏈互補(bǔ)序列，UBamHI和UEcoRI形成USER酶克隆位點(diǎn)1（UCS1），DXhoI和DKpnI形成USER酶克隆位點(diǎn)2（UCS2）。將UCS1連入pKH載體的BamH I和EcoR I位點(diǎn)，UCS2連入XhoI和KpnI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌獲得單克隆測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建載體命名為pKH－KO。

1.3.2 熒光融合蛋白表達(dá)通用載體的構(gòu)建

以pGenGFP載體為模版，用PRIMERSTAR高保真DNA聚合酶，GFPFHindⅢ和GFPRKpnⅠ為引物擴(kuò)增獲得大小1 100bp的GFP－Tnos片段，分別連入pKH和pKN兩個(gè)載體的KpnⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，構(gòu)建載體分別命名為pKHGFPE和pKNGFPE。

1.4 基因敲除與熒光融合蛋白表達(dá)通用載體的應(yīng)用

1.4.1 通用載體的制備

將含有載體pKH－KO、pKHGFPE和pKNGFPE的大腸桿菌接種于含有氨芐的LB培養(yǎng)基，37℃200r／min過夜培養(yǎng)。采用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒（愛思進(jìn)生物技術(shù)公司，杭州）提取質(zhì)粒。超微量分光光度計(jì)NanoVue（GE公司，美國）檢測(cè)質(zhì)粒濃度。采用300μL體系加入70UPacⅠ 后37℃過夜酶切約10μg質(zhì)粒。第2天，再加入20UPacI和40UNt.BbvCI，37℃溫育1h，取2～3μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。然后用Axygen DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，得到終濃度約50ng／μL的通用載體，－20℃保存待用。

1.4.2 禾谷鐮刀菌FgPex 5基因敲除載體的構(gòu)建

根據(jù)禾谷鐮刀菌基因組信息設(shè)計(jì)FgPex 5基因上游序列擴(kuò)增引物P5UF、P5UR和下游引物P5DF、P5DR，并在引物的5′端分別添加 O1、O2和O3、O4序列：

以基因組為模版采用東盛taqmix擴(kuò)增FgPex 5基因的上下游片段P5U和P5D，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物濃度。使用25μL體系進(jìn)行酶切連接，體系包含：

反應(yīng)條件：37℃溫浴20min，25℃溫浴20min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.4.3 禾谷鐮刀菌FgPex 5熒光融合表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)FgPex5基因序列信息設(shè)計(jì)引物P5PF、P5GR，擴(kuò)增包含上游啟動(dòng)子與ORF的序列（不含終止子）P5PG，并在引物的5′端分別添加1.4.2中O3和O4序列。

以基因組為模版，采用PfuTurbo?Cx Hot－start DNA Polymerase（Agilent，600410）擴(kuò)增包含啟動(dòng)子的FgPex 5基因序列P5PG。使用25μL體系進(jìn)行酶切連接，體系包含：

反應(yīng)條件：37℃溫浴20min，25℃溫浴20min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.4.4 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

參考Desmond的方法［22]制備原生質(zhì)體，并將構(gòu)建好的載體用KpnⅠ線性化后進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)化子使用相應(yīng)的潮霉素B或G418進(jìn)行抗性篩選。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers for experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除與熒光融合表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用

構(gòu)建了基因敲除通用載體pKH－KO（圖2a）和熒光融合蛋白表達(dá)通用載體pKHGFPE（圖2b）和pKNGFPE（圖2c）。

本方法通過特定的酶將載體上的USER酶特異位點(diǎn)和兩條PCR重組片段產(chǎn)物消化出互補(bǔ)的黏性末端，通過一次連接反應(yīng)就能將兩條同源重組片段連接到抗性基因的兩側(cè)。在目的基因的兩條同源重組片段擴(kuò)增引物的5′端加上含有尿嘧啶脫氧核苷酸的9個(gè)堿基（圖3a），這樣PCR獲得的同源重組片段在USER酶的作用下就會(huì)被消化出特定黏性末端（圖3b）。使用PacⅠ和Nt.BbvCI兩種酶消化含有UCS序列的通用載體，使其出現(xiàn)與同源重組片段互補(bǔ)的黏性末端（圖3c）。由于互補(bǔ)序列長(zhǎng)達(dá)9個(gè)堿基，上述兩個(gè)消化產(chǎn)物可以在沒有DNA連接酶的條件下直接完成連接反應(yīng)（圖3d）。連接產(chǎn)物可以直接進(jìn)行下一步試驗(yàn)（圖3e）。熒光融合表達(dá)載體的構(gòu)建原理與之相同。

圖2 載體的示意圖Fig.2 The constructed USER vector

圖3 USER酶一步法構(gòu)建基因敲除載體示意圖Fig.3 The USER enzyme strategy for single step construction of gene replacement vectors

2.2 FgPex5基因敲除與GFP融合表達(dá)轉(zhuǎn)化子的鑒定

使用基因敲除通用載體pKH－KO在禾谷鐮刀菌野生型菌株P(guān)H－1中進(jìn)行FgPex 5基因敲除。對(duì)于獲得的轉(zhuǎn)化子采用PCR鑒定的方法進(jìn)行篩選，泳道1、2、3、4為野生型菌株P(guān)H－1電泳結(jié)果，5、6、7、8為FgPex 5基因缺失突變體菌株電泳結(jié)果。用3對(duì)引物檢測(cè)轉(zhuǎn)化子其位置如圖4所示，3對(duì)引物各自作用如下：

1）引物5nF和5nR是用來檢測(cè)目的基因是否被敲除（泳道2、6）；2）引物H852和H850是用來檢測(cè)hph基因的存在（泳道1、5）；3）引物5wF和H852是用來檢測(cè)上游的同源重組的發(fā)生（泳道3、7）；4）引物H850和5wR是用來檢測(cè)下游的同源重組的發(fā)生（泳道4、8）。只有當(dāng)如圖同源重組發(fā)生時(shí)，目的基因才會(huì)被hph基因替換掉。

使用熒光融合蛋白表達(dá)通用載體pKNGFPE導(dǎo)入到菌株中，將孢子和萌發(fā)的菌絲在熒光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2，德國）下觀察并拍照，GFP熒光的激發(fā)波長(zhǎng)在488nm，結(jié)果如圖5所示。

圖4 PCR驗(yàn)證檢測(cè)策略及結(jié)果Fig.4 The PCR analysis of mutants

圖5 熒光定位蛋白信號(hào)圖Fig.5Subcellular localization of GFP fusion protein in the mutants

3 結(jié)論與討論

對(duì)于真菌基因組測(cè)序結(jié)果的初步注釋已經(jīng)預(yù)測(cè)到了大量沒有相關(guān)同源蛋白的假設(shè)蛋白［23]。僅就禾谷鐮刀菌PH－1而論，在13 938個(gè)假設(shè)基因里就有8 091個(gè)基因（占58%）是“保守假設(shè)蛋白”或者“假設(shè)蛋白”一類［24]。面對(duì)如此多的假設(shè)基因和假設(shè)蛋白，我們就需要一個(gè)十分高效的基因敲除策略來研究各個(gè)基因?qū)τ谥虏⌒院痛渭?jí)代謝物方面的影響。

采用傳統(tǒng)方法構(gòu)建基因敲除載體，需要至少兩次酶切、連接、轉(zhuǎn)化分別連接兩個(gè)同源重組片段，而本方法將酶切與連接步驟合并，并且僅需一步可以同時(shí)連接上兩個(gè)片段（圖1），極大地簡(jiǎn)化了工作、提高了效率。影響載體構(gòu)建工作的另一個(gè)限制因素是酶切位點(diǎn)的選擇，克隆片段中的酶切位點(diǎn)直接影響到載體的構(gòu)建，一般的載體可以提供多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行選擇，但面對(duì)全基因組眾多基因來說，仍然是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，特別是熒光融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建中選擇酶切位點(diǎn)的同時(shí)還要考慮兩個(gè)基因之間linker序列的堿基數(shù)目，這就更加限制了酶切位點(diǎn)的選擇。而本方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)就在于采用自身構(gòu)建的9bp互補(bǔ)序列進(jìn)行連接，完全省去了酶切位點(diǎn)選擇的步驟，這為載體的構(gòu)建從設(shè)計(jì)上減輕了很大的工作量。同時(shí)，相對(duì)于普通酶切位點(diǎn)2～3個(gè)堿基黏性末端的連接，本方法中長(zhǎng)達(dá)9bp的黏性末端在不用DNA連接酶的情況下使連接效率得到了很大的提高。近年來split－marker方法［25]構(gòu)建敲除載體在鐮刀菌的基因功能分析中得到了比較廣泛的應(yīng)用［11，26]，與傳統(tǒng)方法相比，步驟簡(jiǎn)單，省時(shí)省力。但在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)，不同基因重疊PCR條件差異較大，經(jīng)常出現(xiàn)重疊失敗或者重疊擴(kuò)增效率低、產(chǎn)物量少，不足以進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)化的情況，摸索最佳條件往往花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間。而本方法所采用的全部是最基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，成功率高，更易于上手操作。

使用本文的方法進(jìn)行載體構(gòu)建由于擴(kuò)增引物中含有dU，所以需要注意DNA聚合酶的選擇。來源于真細(xì)菌的Taq酶可以擴(kuò)增dU，對(duì)于片段較短、保真性要求不高的基因敲除載體構(gòu)建可以選用Taq酶。而構(gòu)建熒光融合表達(dá)載體則需要擴(kuò)增包含啟動(dòng)子的整個(gè)基因，片段較長(zhǎng)并且要求不能有堿基錯(cuò)誤，這就需要用高保真DNA聚合酶。但一般來源于古細(xì)菌的高保真DNA聚合酶如Vent、Pfu等均無法正常擴(kuò)增dU［27]。因此，本研究選用了目前唯一能夠擴(kuò)增dU的高保真DNA聚合酶PfuTurbo?Cx Hotstart DNA Polymerase（Agilent，600410）進(jìn)行擴(kuò)增，取得了很好的效果。

本實(shí)驗(yàn)室通過使用USER酶一步載體構(gòu)建法構(gòu)建了禾谷鐮刀菌十幾個(gè)過氧化物酶體基因（如Fg－Pex5基因）的敲除載體與綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體，進(jìn)行了原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，獲得了大量的基因敲除轉(zhuǎn)化子，在轉(zhuǎn)化效率上與傳統(tǒng)載體構(gòu)建方法相比沒有明顯差異。采用這種方法構(gòu)建目的載體十分適合高通量的基因敲除與熒光融合表達(dá)試驗(yàn)［27]。這種方法對(duì)于在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行鐮刀菌基因敲除和蛋白定位等基因功能的研究有著很大的應(yīng)用前景。

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