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    酶切型穩(wěn)定同位素標記肽段為內(nèi)標用于藥物代謝酶的絕對定量分析

    2015-11-03 07:38:01劉喜東等
    分析化學(xué) 2015年10期
    關(guān)鍵詞:酶切位點

    劉喜東等

    摘 要 利用帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段作內(nèi)標,采取3種方式處理樣品,考察了不同的樣品處理過程對實驗結(jié)果準確性的影響。首先合成不同長度的帶有酶切位點的肽段,考察其酶解過程,實驗結(jié)果表明,胰蛋白酶的活性位點具有一定的選擇性,最終確定目標肽段兩端分別加入3個氨基酸所形成的肽段為內(nèi)標。分別采用在酶解前加入帶酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段、不帶酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段以及在酶解過程后、質(zhì)譜檢測前加入不帶酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段3種方式處理樣品。結(jié)果表明,采取第一種方式處理樣品的測定結(jié)果更接近真實值,相對偏差范圍更小,可減小蛋白質(zhì)絕對定量分析的誤差,提高分析結(jié)果的重現(xiàn)性。

    關(guān)鍵詞 穩(wěn)定同位素標記肽段; 絕對定量; 酶切位點; 藥物代謝酶

    1 引 言

    隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入,以及研究技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究正逐漸成為該領(lǐng)域方法學(xué)研究的熱點,使得蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容更加直觀和具體[1~3]。鑒于蛋白質(zhì)分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類較多、同源性較高、不易純化等特點,研究人員多采用生物質(zhì)譜技術(shù)和穩(wěn)定同位素標記聯(lián)用技術(shù)進行蛋白質(zhì)的相對定量和絕對定量研究。目前,主要的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有穩(wěn)定同位素代謝標記法(Stable isotope labeling with amino acid in cell culture, SILAC)[4,5]、穩(wěn)定同位素標簽標記法(如Isotope coded affinity tags, ICAT; Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)[6]、以及穩(wěn)定同位素標記的氨基酸、肽段、蛋白質(zhì)和肽段串聯(lián)體(Concatamers of Q peptides, QconCAT)[7,8]作為內(nèi)標的蛋白質(zhì)定量方法。

    藥物代謝酶是催化藥物在體內(nèi)代謝的一類蛋白酶,影響藥物在體內(nèi)的有效性和安全性,在藥物開發(fā)過程中受到廣泛關(guān)注[9,10]。近年來,已有文獻基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對藥物代謝酶進行定量研究[11~15],但是考慮到樣品的處理過程對測定結(jié)果的影響,不同方法都有各自的缺陷。為了盡量降低樣品的處理過程對測定結(jié)果的影響,本實驗設(shè)計帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段作為內(nèi)標,使內(nèi)標肽段和肝微粒體樣本經(jīng)過共同的樣品處理過程,使得測定結(jié)果更準確可靠。實驗中同時對經(jīng)過不同樣品處理過程所得測定結(jié)果進行對比分析,探討樣品處理過程對測定結(jié)果的影響,提出適用于藥物代謝酶及其它蛋白質(zhì)定量的合理方案。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    Qtrap 5500型串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司),配有電噴霧離子化源以及Analyst 1.5.2 數(shù)據(jù)處理軟件; Eksigent nanoLC as-2液相系統(tǒng)(美國Eksigent),實驗室自制毛細管Trap柱(2 cm×100 μm),Magic TM C18反相色譜柱(10 cm×75 μm,3 μm); MALDI-TOF/TOF 5800質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)。

    肽段HEIQRFADLAPIGLPHRVTKDT, IQRFADLAPIGLPHRVTK和RFADLAPIGLPHRV,穩(wěn)定同位素標記肽段SVFDQDPFLLR*, VHEEIEQVIGR*, FADIVPTNIPHMTSR*, LGRSVFDQDPFLLR*VVK, EAKVHEEIEQVIGR*NRQ和VQRFADIVPTNIPHMTSR*DIK(上海楚肽生物科技有限公司); 甲酸(色譜純,德國Fluka公司); 尿素、碳酸氫銨、胰蛋白酶、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA),色譜純乙腈(美國Sigma-Aldrich公司); 二硫蘇糖醇(美國Promega公司); 碘乙酰胺(美國New Jersey公司)。實驗用水為Milli-Q超純水(美國Millpore公司)。大鼠肝微粒體樣品為實驗室自制[15]。

    2.2 色譜與質(zhì)譜條件

    流動相A相: 乙腈-水-甲酸(2∶98∶0.1, V/V),B相: 乙腈-水-甲酸(98∶2∶0.1, V/V); 流速為380 nL/min。梯度洗脫程序: 0~30 min,95%~70% A; 30~33 min, 70%~20% A; 33~38 min,20% A; 38~40 min,20%~95% A; 40~45 min,95% A。進樣體積: 5 μL。

    電噴霧離子源溫度(TEM): 150℃; 霧化氣壓力(GS1): 30 psi(0.2 MPa); 氣簾氣壓力(CUR): 15 psi(0.1 MPa); 正離子反應(yīng)模式; 離子模式噴霧電壓(IS): 2200 V; 多反應(yīng)監(jiān)測模式離子對、碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)等參數(shù)見表1。

    2.3 特征肽段溶液的配制

    取各肽段標準品,加水溶解,得1 nmol/μL各肽段儲備液,于-20℃保存?zhèn)溆谩H「麟亩蝺湟?,用水稀釋,按?配制相應(yīng)的肽段溶液。

    2.4 考察帶有酶切位點肽段的酶解過程

    分別取90 μL緩沖溶液(50 mmol/LNH4HCO3)置于3個1.5 mL EP管中,分別加入10 μL肽段溶液1、肽段溶液2和肽段溶液3,再加入2 μL胰蛋白酶溶液(0.5 μg/μL),渦流混勻,在37℃恒溫振蕩。分別于0, 5, 30和120 min取樣10 μL,加入2 μL甲酸酸化,終止反應(yīng)。以CHCA為基質(zhì),進行質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)測定。

    2.5 3種加入內(nèi)標肽段形式的方法考察

    取3個1.5 mL EP管,編號為A1, A2和A3,每管中加入15 μL大鼠肝微粒體樣品(5 mg/mL)、75 μL緩沖溶液Ⅰ(50 mmol/L NH4HCO3、8 mol/L Urea)、8 μL二硫蘇糖醇溶液(300 mmol/L); 分別向A1, A2和A3管中分別加入10 μL肽段溶液4、肽段溶液5和水,并渦流混勻,于37℃恒溫振蕩1 h; 向A1, A2和A3管中分別加入24 μL新鮮配制的碘乙酰胺溶液(300 mmol/L),渦流混勻,于25℃恒溫避光振蕩40 min; 向A1, A2和A3管中分別加入400 μL緩沖溶液Ⅱ(50 mmol/L NH4HCO3),渦流混勻,再加入胰蛋白酶溶液(0.5 μg/μL),于37℃恒溫振蕩; 于37℃酶解10 min后,加入甲酸溶液酸化,終止反應(yīng); 酶解液通過固相萃取去除雜質(zhì),用1 mL 乙腈-水-TFA(80∶ 20∶ 0.1,V/V)溶液洗脫,后于25℃離心熱干。向A1、A2管中加入50 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶,向A3管中加入40 μL 0.1%甲酸溶液和10 μL肽段溶液5復(fù)溶。取5 μL進樣測定。

    重復(fù)上述步驟,制備酶解0.5, 2, 6和16 h的肝微粒體樣品,并進行測定,考察酶解時間對測定結(jié)果的影響。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 帶有酶切位點肽段的酶解過程考察

    在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,可采用穩(wěn)定同位素標記肽段作為內(nèi)標,實現(xiàn)對目標蛋白的定量分析。在具體實驗操作過程中,不同研究者加入內(nèi)標肽段的步驟并不相同,包括在蛋白樣品酶解后、質(zhì)譜檢測前加入內(nèi)標肽段; 或者在蛋白樣品酶解前加入內(nèi)標肽段,使內(nèi)標肽段與樣品共同進行酶解過程和樣品除鹽純化過程??紤]到肽段在樣品酶解過程中部分降解,以及樣品處理過程中肽段的損失,因此越早將內(nèi)標肽段和蛋白樣品混合,理論測定結(jié)果越可靠。由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,蛋白質(zhì)的酶解速率和酶解程度對測定結(jié)果也會有影響,穩(wěn)定同位素標記的蛋白質(zhì)或肽段串聯(lián)體等方法即是希望通過同步酶解過程以降低酶解過程帶來的誤差,但穩(wěn)定同位素標記的蛋白質(zhì)或串聯(lián)體的制備過程相對復(fù)雜且成本較高。因此,本研究設(shè)計帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段作為內(nèi)標,加入到肝微粒體樣品中,進行同步酶解和樣品處理過程,以最大限度地提高蛋白樣品測定的準確性。

    實驗中,首先以肽段FADLAPIGLPHR為研究對象,合成具有不同氨基酸數(shù)目的帶有酶切位點的肽段,考察RFADLAPIGLPHRV、IQRFADLAPIGLPHRVTK和HEIQRFADLAPIGLPHRVTKDT的酶解過程,以選擇合適的帶有酶切位點的內(nèi)標肽段。由圖1可見,當目標肽段(FADLAPIGLPHR)兩端分別添加1個氨基酸時,RFADLAPIGLPHRV不能被酶解產(chǎn)生FADLAPIGLPHR; 當目標肽段兩端分別加上3個和5個氨基酸時,IQRFADLAPIGLPHRVTK和HEIQRFADLAPIGLPHRVTKDT都能被酶解產(chǎn)生FADLAPIGLPHR,說明胰蛋白酶的活性位點具有一定的選擇性,能選擇性的對肽段進行酶切。為了達到內(nèi)標肽段能被酶切的目的,并考慮到節(jié)約實驗成本,本實驗采用在目標肽段兩端分別加上3個氨基酸的研究方案。

    實驗中考察了肽段IQRFADLAPIGLPHRVTK的酶解過程。如圖2所示,肽段IQRFADLAPIGLPHRVTK的兩個酶切位點不是同時進行酶切的,這可能與酶切位點處氨基酸的性質(zhì)有關(guān)。通過延長酶解時間,可實現(xiàn)對帶有酶切位點肽段的完全酶切。

    3.2 藥物代謝酶定量方法的建立

    實驗以UGT1A1、CYP2A1和CYP2D26為研究對象,其水解后可產(chǎn)生的特征肽段分別為SVFDQDPFLLR、VHEEIEQVIGR和FADIVPTNIPHMTSR,通過計算樣品中的特征肽段與其已知濃度同位素標記肽段的峰面積比值,得到特征肽段含量,計算得出酶含量。為了提高方法的可靠性,降低儀器因素對測定結(jié)果的影響,質(zhì)譜檢測時針對每個肽段選用兩個離子對進行定量分析,取兩個結(jié)果的平均值進行計算。

    以3種形式加入同位素標記內(nèi)標肽段,分別為: 在肝微粒體樣品酶解前加入帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段,使內(nèi)標肽段和樣品進行同步酶解和樣品處理過程; 在肝微粒體樣品酶解前加入不帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段,使內(nèi)標肽段和樣品進行同步酶解和樣品處理過程; 在肝微粒體樣品經(jīng)過酶解和樣品處理后、質(zhì)譜檢測前,加入不帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段。本研究組曾采用第III種方法對大鼠肝微粒體中細胞色素P450和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶亞型進行了絕對定量分析[15],但沒有與前兩種方式做系統(tǒng)比較。本實驗系統(tǒng)考察了3種形式加入穩(wěn)定同位素標記肽段做內(nèi)標對定量結(jié)果的影響。

    3.3 酶解過程時間長短對測定結(jié)果的影響

    以上述3種方式加入內(nèi)標肽段,分別在10 min, 30 min, 2 h, 6 h和16 h終止反應(yīng),考察不同酶解作用時間下3種方式加入內(nèi)標的結(jié)果。以特征肽段SVFDQDPFLLR為例,分別計算3種形式加入內(nèi)標時,各時間點測定結(jié)果的平均值,再計算每個時間點的測定值相對于平均值的相對偏差,以時間點為橫坐標,各時間點測定結(jié)果的相對偏差為縱坐標作圖(圖3)。圖3中各點可表示不同形式加入內(nèi)標時,樣品中特征肽段實際含量的相對變化。

    如圖3a所示,對于特征肽段SVFDQDPFLLR,隨著時間延長,以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量先增加后略降低,在10 min時,蛋白沒有完全酶解,測定值負偏差較大,在2 h時蛋白基本完全酶解成肽段,隨后產(chǎn)生的特征肽段發(fā)生部分降解; 以第Ⅰ、Ⅱ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量逐漸增加,說明添加的內(nèi)標肽段也發(fā)生部分降解,特征肽段與內(nèi)標肽段在樣品中變化一致,測定結(jié)果更接近真實值。以第Ⅰ和Ⅱ種方式加入內(nèi)標肽段時測定值基本一致,說明帶有酶切位點肽段在樣品中迅速酶解。

    如圖3b所示,對于特征肽段VHEEIEQVIGR,隨著時間延長,以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量先增加,后稍許降低,在10 min時,蛋白沒有完全酶解,測定值負偏差較大,在2 h時,蛋白基本完全酶解; 以第Ⅱ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量逐漸增加,在16 h時正偏差較大,說明蛋白酶解產(chǎn)生的特征肽段降解程度多于內(nèi)標肽段; 以第Ⅰ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量整體趨勢逐漸降低,在10 min時,正偏差較大,說明帶有酶切位點的內(nèi)標肽段沒有酶解完全,在2 h時,基本酶解。以第Ⅰ、Ⅱ種方式加入內(nèi)標肽段時,后3個時間點的測定值變化趨勢一致,說明帶有酶切位點的內(nèi)標肽段和無酶切位點內(nèi)標肽段在樣品中變化過程一致。

    如圖3c所示,對于特征肽段FADIVPTNIPHMTSR,隨著時間延長,以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量先增加,后顯著降低,說明在10 min時,蛋白沒有完全酶解,等蛋白完全水解成肽段后,特征肽段又明顯降解,使得測定值負偏差較大; 以第Ⅱ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量逐漸增加,后基本不變,說明加入的內(nèi)標肽段也發(fā)生降解,降解速度與特征肽段一致; 以第Ⅰ種方式加入內(nèi)標肽段時,測得特征肽段的含量先增加,后基本不變,說明在10 min時,帶有酶切位點的內(nèi)標肽段沒有酶解完全。由于蛋白酶解產(chǎn)生的特征肽段發(fā)生降解,當加入帶有酶切位點的內(nèi)標肽段時,特征肽段與內(nèi)標肽段在樣品中變化過程基本一致,測定值更接近真實值。

    上述3種特征肽段的定量結(jié)果反映了以同位素標記肽段作為內(nèi)標進行蛋白定量時的普遍問題。如圖3a所示,由于蛋白水解產(chǎn)生的特征肽段發(fā)生降解,以第Ⅲ種方式加入內(nèi)標肽段時,測定的結(jié)果與理論值相比偏低; 如圖3b所示,以第Ⅱ種方式加入內(nèi)標肽段時,測定的結(jié)果與真實值更接近,但是特征肽段從生成后開始稍許降解,而內(nèi)標肽段從加入后開始稍許降解,測定結(jié)果比真實值稍偏大; 如圖3c所示,以第Ⅰ種方式加入內(nèi)標肽段時,由于帶有酶切位點的內(nèi)標肽段需要經(jīng)過酶切過程,內(nèi)標肽段與蛋白在樣品中的過程更接近一致,使最終的測定結(jié)果更接近真實值,相對偏差范圍更小。因此,選用帶有酶切位點的同位素標記肽段作為內(nèi)標時,對蛋白質(zhì)的定量結(jié)果更接近真實值,方法的偏差也最小。

    3.4 基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的藥物代謝酶定量方法總結(jié)

    利用LC-MS/MS技術(shù),通過計算特征肽段與其同位素標記肽段峰面積的比值來測定蛋白的含量是目前公認的最佳的的蛋白質(zhì)定量方法,但是需要注意以下問題: (1)需考察特征肽段在樣品處理過程中的穩(wěn)定性,盡量選擇在樣品長時間處理過程中較穩(wěn)定的特征肽段; (2)對于內(nèi)標肽段,可將其與樣品混合后再進行樣品酶解等處理過程,這樣可以降低樣品處理過程引入的偏差; (3)內(nèi)標肽段的純度可用氨基酸水解法進行標定,保證內(nèi)標肽段的含量準確; (4)可選擇帶有酶切位點的標記肽段或標記肽段的串聯(lián)體(QconCAT)作為內(nèi)標[16],提高方法的準確性,特別適用于難以確定穩(wěn)定的特征肽段的蛋白序列,但是需要考察每個內(nèi)標肽段的酶解過程,這樣才能準確評價計算結(jié)果的準確性; (5)蛋白樣品的處理過程可根據(jù)特征肽段的特點進行優(yōu)化,包括樣品的酶解過程的時間和體系中酶濃度等。

    References

    1 Pennington S R, Wilkins M R, Hochstrasser D F, Dunn M J. Trends Cell Biol., 1997, 7(4): 168-173

    2 Wilkins M R, Sanchez J C, Gooley A A, Appel R D, Humphery-Smith I, Hochstrasser D F, Williams K L. Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 1996, 13: 19-50

    3 WEI Jun-Ying, ZHANG Yang-Jun, ZHAO Yan, CHEN Xi-Shu, MA Yan, YING Wan-Tao, QIAN Xiao-Hong. Chinese J. Anal. Chem., 2012, 40(1): 59-65

    衛(wèi)軍營, 張養(yǎng)軍, 趙 炎, 陳希曙, 馬 巖, 應(yīng)萬濤, 錢小紅. 分析化學(xué), 2012, 40(1): 59-65

    4 ZHU Jin-Lei, ZHANG Kai, HE Xi-Wen, ZHANG Yu-Kui. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38(3): 434-441

    朱金蕾, 張 鍇, 何錫文, 張玉奎. 分析化學(xué), 2010, 38(3): 434-441

    5 ZHOU Yuan, SHAN Yi-Chu, ZHANG Li-Hua, ZHANG Yu-Kui. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(6): 496-502

    周 愿, 單亦初, 張麗華, 張玉奎. 色譜, 2013, 31(6): 496-502

    6 CAO Dong, ZHANG Yang-Jun, QIAN Xiao-Hong. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2008, 29(3): 185-191

    曹 冬, 張養(yǎng)軍, 錢小紅. 質(zhì)譜學(xué)報, 2008, 29(3): 185-191

    7 Rivers J, Simpson D M, Robertson D H, Gaskell S J, Beynon R J. Mol. Cell Proteomics, 2007, 6(8): 1416-1427

    8 Austin R J, Chang D K, Holstein C A, Lee L W, Risler J, Wang J H, Adams L, Krusberski N B, Martin D B. Proteomics, 2012, 12(13): 2078-2083

    9 Emoto C, Murase S, Iwasaki K. Xenobiotica, 2006, 36(8): 671-683

    10 Kanayama N, Kanari C, Masuda Y, Ohmori S, Ooie T. Xenobiotica, 2007, 37(2): 139-154

    11 Ardjomand-Woelkart K, Kollroser M, Li L, Derendorf H, Butterweck V, Bauer R. Anal. Bioanal. Chem., 2011, 400(8): 2371-2381

    12 Groer C, Busch D, Patrzyk M, Beyer K, Busemann A, Heidecke C D, Drozdzik M, Siegmund W, Oswald S. J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 100: 393-401

    13 Al Ali A, Touboul D, Le Caer J P, Schmitz-Afonso I, Flinois J P, Marchetti C, De Waziers I, Brunelle A, Laprevote O, Beaune P. Anal. Bioanal. Chem., 2014, 406(20): 4861-4874

    14 Liu X D, Hu L H, Ge G B, Yang B, Ning J, Sun S X, Yang L, Pors K, Gu J K. Proteomics, 2014, 14(16): 1943-1951

    15 LIU Xi-Dong, ZHU Jun, CONG Yu-Ting, HU Liang-Hai, YE Ming-Liang, GU Jing-Kai, ZOU Han-Fa. Chinese J. Anal. Chem., 2014, 42(1): 10-15

    劉喜東, 朱 俊, 叢宇婷, 胡良海, 葉明亮, 顧景凱, 鄒漢法. 分析化學(xué), 2014, 42(1): 10-15

    16 Wei J Y, Ding C, Zhang J, Mi W, Zhao Y, Liu M W, Fu T Y, Zhang Y J, Ying W T, Cai Y, Qin J, Qian X H. Anal. Bioanal. Chem., 2014, 406(17): 4183-4193

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