盧凌霄,高珊,于洋,王銀月,鄒春野,于鴻雪,呂小飛
(遼源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林 遼源 136200)
常規(guī)水稻、哥倫比亞生態(tài)型(Columbia,Col)擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子均由本實(shí)驗室保存。
中間載體pUC-19、黃色熒光融合瞬時表達(dá)載體pSAT6-EYFP 均由本實(shí)驗室保存,pEASY-T5 cloning vector 購于北京Transgen 公司,大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞購于北京Transgen 公司。
PCR 擴(kuò)增所需引物均在上海生工生物工程公司合成,KOD FX 及rTaq 購買于TOYOBO 生物技術(shù)公司,各種DNA 限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶均購買于美國New England Biolabs(北京)公司,DNA Marker 和蛋白Marker 購買于TaKaRa 公司。
質(zhì)粒提取試劑盒購于GeneStar 公司,DNA 膠回收試劑盒購于Omega 公司。
1)Act2-1啟動子克隆。CTAB法提取水稻總DNA,NCBI檢索Os Actin2-1 序列(GenBank:EU259512.1 1 008 bp),設(shè)計引物,分段PCR 法擴(kuò)增目標(biāo)片段P1(880 bp)、P2(120 bp),膠回收片段P1、P2,T4 DNA 連接酶連接兩片段得到完整Actin2-1 啟動子,克隆載體測序與目標(biāo)序列比對。啟動子序列中存在一個PstI 酶切位點(diǎn),影響后續(xù)載體構(gòu)建,設(shè)計引物突變掉克隆所得片段中的PstI 酶切位點(diǎn),見表1。
表1 設(shè)計引物序列
2)Ubi 啟動子改造。玉米Ubiquitin 啟動子為實(shí)驗室保存,序列中有一個EcoR I 酶切位點(diǎn),影響后續(xù)載體構(gòu)建,需設(shè)計引物將酶切位點(diǎn)鈍化,改造后的Ubi 啟動子需進(jìn)行功能驗證。
2.2.1 黃色熒光瞬時表達(dá)載體構(gòu)建
利用 In-Fusion 方法構(gòu)建瞬時表達(dá)載體pACT-EYFP 和pUBI-EYFP,利用AgeI 和EcoR V 酶切位點(diǎn)以In-Fusion 無縫克隆方法將35S 啟動子分別替換為克隆并改造得到的Act2-1 和Ubi 啟動子,利用QIAGEN 大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。
2.2.2 原生質(zhì)體制備及瞬時轉(zhuǎn)化所需母液
配制200 mL 0.8 mol/L 甘露醇,0.2 mol/L MES,1 mol/L CaCl2,1 mol/L KCl,2 mol/L MgCl2,5 mol/L NaCl,50 mL 10%BSA,滅菌室溫保存。
2.2.3 配制工作液
1)酶解液(20 mL):取0.2 mol/L MES 母液20 mL于70 ℃預(yù)熱3 min后,加入1.5%Cellulase R10、0.4%Macerozyme R10、0.4 mol/L mannitol、1 mol/L KCl 母液0.4 mL,55 ℃水浴10 min,冷卻后加入1 mol/L CaCl2200 μL、10%BSA 200 μL。
2)W5 溶液(100 mL):取0.2 mol/LMES 1 mL、5 mol/L NaCl 6.16 mL、1 mol/L CaCl212.5 mL、1 mol/L KCl 500μL,加入滅菌的ddH2O 至100 mL。
3)MMG 溶液(100 mL):取0.2 mol/L MES 2 mL、0.8mol/L mannitol 50 mL、2 mol/L MgCl21.5 mL,加入滅菌的ddH2O 至100 mL。
4)WI 溶液(100 mL):取0.2 mol/L MES 2 mL、0.8 mol/L mannitol 62.5 mL、1 mol/L KCl 2 mL,加入滅菌的ddH2O 至100 mL。
5)PEG 溶液(10 mL):稱取PEG4 g、0.2 mol/Lmannitol 1 mL、1 mol/L CaCl21 mL,加入滅菌的ddH2O 8 mL,55 ℃水浴促進(jìn)溶解,提前1 h 配制。
2.2.4 制備擬南芥原生質(zhì)體,并瞬時轉(zhuǎn)化表達(dá)載體
1)剪取21 d 左右的未抽薹擬南芥葉片,用刀片將葉片切成細(xì)條,浸于5 mL 酶解液中,輕輕搖晃。
2)放入25 ℃培養(yǎng)箱中,用錫箔紙包住避光酶解3 h 后形成綠色酶/原生質(zhì)體溶液,期間可以汲取少量液體在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體狀態(tài)。
3)加入W5 溶液5 mL,用75 μm 過濾篩過濾到圓底離心管中。
4)使用水平低速離心機(jī),配平后100 rpm 離心2 min,小心吸出上清液。
5)加入W5 溶液2 mL 重懸,冰上放置30 min,原生質(zhì)體會沉降至管底。
6)小心吸出清液,加入MMG 溶液2 mL 重懸,按轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒數(shù)均勻地分到無菌的離心管中。
7)按每100 μL 原生質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化1 μg 質(zhì)粒,將質(zhì)粒稀釋后加到原生質(zhì)體細(xì)胞中,輕輕混勻后,緩慢加入PEG 溶液110 μL(邊加邊混勻),避光放置10 min。
8)加入W5 溶液400 μL,輕輕混勻后,終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
9)以離心力100 g 離心2 min,吸出上清液,加入WI 溶液1 mL 重懸,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中。
10)25 ℃避光過夜孵育。
11)取100 μL 溶液于激光共聚焦顯微鏡下觀察啟動子啟動表達(dá)熒光蛋白的情況。
PCR 擴(kuò)增出的P1、P2 片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,見圖1(a),HindⅢ和BamHⅠ雙酶切中間載體pUC-19,與酶切處理過的P1、P2 片段連接,獲得pUC-Act,菌落PCR 和雙酶切驗證,見圖1(b)和圖1(c)。
使用突變PstI 位點(diǎn)引物PCR 擴(kuò)增,可分別得到830 bp 和210 bp 的兩個片段,見圖1(d),回收兩個片段作為模板擴(kuò)增得到突變了酶切位點(diǎn)的完整Act2-1啟動子片段,回收片段連接到克隆載體pEASY-Blunt Zero上,進(jìn)行菌落PCR 和雙酶切驗證,經(jīng)測序驗證獲得突變了PstI 位點(diǎn)完整Act2-1 啟動子,見圖2。
圖1 Act2-1 啟動子的克隆
圖2 Act2-1 啟動子序列
Ubi 啟動子全長2 035 bp,使用鈍化酶切位點(diǎn)EcoR I 引物擴(kuò)增兩片段大小分別為1 415 bp、651 bp,回收兩個片段作為模板,使用上下游引物第二輪擴(kuò)增出Ubi 啟動子全長,連接到克隆載體上挑選陽性克隆進(jìn)行測序,獲得突變EcoR I 酶切位點(diǎn)的Ubi 啟動子。
利用In-Fusion 方法構(gòu)建表達(dá)載體pACT-EYFP和pUBI-EYFP,大提質(zhì)粒。與攜帶35s 啟動子的對照載體一起瞬時轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體,激光共聚焦顯微鏡下觀察啟動子是否能正常啟動黃色熒光蛋白表達(dá)。對照35S::YFP 能夠正常表達(dá)熒光蛋白,經(jīng)克隆改造得到的Act2-1 和Ubi 啟動子也均觀測到黃色熒光蛋白,見圖3,證明試驗所得啟動子具有啟動蛋白表達(dá)功能。
圖3 擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)黃色熒光蛋白
根據(jù)NCBI 檢索Os Actin2-1 序列,PCR 法克隆得到Actin2-1 啟動子,與檢索序列同源性達(dá)100%,在此基礎(chǔ)上突變掉礙于下一步載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn),得到新的Act2-1 啟動子;在已有的玉米Ubiquitin 啟動子基礎(chǔ)上使用PCR 法突變掉EcoR I 酶切位點(diǎn),使其便于下一步自有載體構(gòu)建體系的應(yīng)用。
使用擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化Act2-1、Ubiquitin啟動子構(gòu)建的黃色熒光瞬時表達(dá)載體,以黃色熒光蛋白基因作為報告基因,激光共聚焦顯微鏡下觀察瞬時轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體,可觀測到黃色熒光蛋白的表達(dá),證明克隆得到的新啟動子具有啟動功能,可以用于單子葉植物表達(dá)載體的構(gòu)建。