• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一種快速構(gòu)建集胞藻6803 petBD必需基因定點(diǎn)突變株的方法

    2014-03-17 00:49:24蘆亞菲曲娜陳曉波匡廷云
    水生生物學(xué)報(bào) 2014年5期
    關(guān)鍵詞:酶切位點(diǎn)同源定點(diǎn)

    蘆亞菲曲 娜陳曉波匡廷云

    (1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050018; 2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所, 光生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100093)

    一種快速構(gòu)建集胞藻6803 petBD必需基因定點(diǎn)突變株的方法

    蘆亞菲1曲 娜1陳曉波1匡廷云2

    (1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050018; 2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所, 光生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100093)

    集胞藻6803(Synechocystis sp. Strain PCC 6803)是能夠進(jìn)行光合自養(yǎng)的原核生物, 因其遺傳背景清楚, 特別是它具有天然的同源重組轉(zhuǎn)化能力, 是研究光合作用的模式生物之一[1—3]。以集胞藻進(jìn)行分子生物學(xué)研究, 最常用的方法是基因敲除, 即基于同源重組原理, 利用抗生素的抗性基因插入到目的基因內(nèi)部, 使其功能喪失[4]; 如進(jìn)行定點(diǎn)突變常規(guī)的方法是首先構(gòu)建一個(gè)缺失質(zhì)粒, 通過同源重組缺失目的基因的部分片段; 然后再構(gòu)建一個(gè)回復(fù)突變質(zhì)粒, 在回復(fù)質(zhì)粒內(nèi)部設(shè)計(jì)突變位點(diǎn), 利用同源重組把缺失的基因片段(已經(jīng)包含了突變的位點(diǎn))再次重組進(jìn)基因組, 與此同時(shí)引入第二種抗生素基因, 以第二種抗生素篩選轉(zhuǎn)化子, 經(jīng)連續(xù)篩選, 即可獲得定點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)化子[5—7]。由于這種方法涉及基因的刪除, 所以如果要對(duì)必需基因進(jìn)行定點(diǎn)突變, 顯然不能采用這種方法。

    本研究在參閱相關(guān)研究文獻(xiàn)[6—8]的基礎(chǔ)上, 采用了一種改進(jìn)的方法, 對(duì)集胞藻的必需基因pet BD基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變。Pet BD基因編碼光合膜蛋白細(xì)胞色素 b6f蛋白復(fù)合體的細(xì)胞色素 b6和亞基Ⅳ這兩個(gè)蛋白亞基, 兩個(gè)基因之間有一段約200 bp的非編碼區(qū)。該方法基本原理是在構(gòu)建集胞藻同源重組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒時(shí), 在定點(diǎn)突變位點(diǎn)上游的非編碼區(qū)內(nèi)引入一個(gè)特異酶切位點(diǎn), 經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子后, 以引入的酶切位點(diǎn)作為第二個(gè)篩選標(biāo)記鑒定轉(zhuǎn)化子。在本實(shí)驗(yàn)中為獲得 pet D基因的定點(diǎn)突變株,在其上游pet B和pet D之間的非編碼區(qū)引入了一個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)。本研究使用上述方法, 最終鑒定了三個(gè) b6f蛋白復(fù)合體亞基Ⅳ的定點(diǎn)突變株, 單突Gly136Ala、單突Thr137Ala 以及雙突Gly136Ala/ Thr137Ala。該方法是在集胞藻常規(guī)同源重組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)建的基礎(chǔ)上稍加改進(jìn),克服了常規(guī)的基因敲除法不能構(gòu)建必需基因定點(diǎn)突變株的缺陷, 并且可以快速預(yù)篩選出定點(diǎn)突變株, 為后續(xù)的測(cè)序節(jié)約成本。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

    集胞藻6803藻種為本實(shí)驗(yàn)室保存。集胞藻培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)[1, 9], 突變株培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中加入終濃度為25 μg/mL的卡那霉素。

    宿主菌E. coli DH5ɑ用于質(zhì)粒擴(kuò)增的, 本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET 30a, 宿主菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞, pUC18質(zhì)粒購(gòu)自TransGen公司。

    1.2 試劑與工具酶

    ExTaq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Pfu DNAPolymerase 購(gòu)自TaKaRa公司; 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EheⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ購(gòu)自Fermentas公司; DNA ligase、Trans Taq-T DNA Polymerase、Fast Mutagenesis System購(gòu)自TransGen公司; 卡那霉素購(gòu)自Sigma公司。DNA小提中量試劑盒, 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自索萊寶生化科技(北京)有限公司。PCR引物合成以及DNA序列測(cè)序交由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司完成。

    1.3 同源重組載體的構(gòu)建

    參照Putnam-Evans等[6,7]和Yan等[8]的方法構(gòu)建載體,方法如下: 根據(jù)NCBI上提供的集胞藻6803petBD基因序列及其上下游序列和 pET 30a質(zhì)粒中抗卡那霉素基因的表達(dá)框序列, 分別設(shè)計(jì)引物(Up-F、Up-R、Down-F、Down-R和 Kanr-F、Kanr-R; 表 1), 以集胞藻基因組和pET30a質(zhì)粒為模板, 擴(kuò)增出上、下游片段和抗性基因Kanr片段。按上游序列-Kanr片段-下游序列的順序連接到pUC18質(zhì)粒上。

    采用 TransGen 公司的快速突變?cè)噭┖?Fast Mutagenesis System), 選擇在petB和petD基因之間的非編碼區(qū)的一段序列AAGATT, 設(shè)計(jì)引物HindⅢ-F和HindⅢ-R(表 1), 進(jìn)行一個(gè)堿基的突變, 引入 HindⅢ酶切位點(diǎn)(AAGCTT), 構(gòu)建成pUC-petBD同源重組質(zhì)粒。

    根據(jù)集胞藻6803亞基IV的氨基酸編碼序列設(shè)計(jì)三個(gè)氨基酸定點(diǎn)突變質(zhì)粒的引物(G-F、G-R; T-F、T-R; D-F、D-R;表1), 采用TransGen公司的快速突變?cè)噭┖? 以pUC-petBD質(zhì)粒為模板, 構(gòu)建三個(gè)氨基酸定點(diǎn)突變質(zhì)粒, 即單突Gly136Ala、單突Thr137Ala 和雙突Gly136Ala/Thr137Ala。

    1.4 集胞藻6803的自然轉(zhuǎn)化

    集胞藻6803的自然轉(zhuǎn)化按照Williams描述的方法[10]。

    1.5 突變株的鑒定

    以野生型集胞藻6803和三個(gè)定點(diǎn)突變株的基因組為模板, 分別用 K-F、K-R(表 2)引物鑒定 Kanr片段重組結(jié)果, HindIIIJD-F、HindIIIJD-R(表 2)引物鑒定引入的HindIII酶切位點(diǎn)是否已重組到集胞藻基因組中, 最后用petD-F、petD-R(表2)引物擴(kuò)增petD片段, 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

    2 結(jié)果

    2.1 定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建

    同源重組質(zhì)粒 pUC-petBD的構(gòu)建圖譜見圖 1。為了驗(yàn)證構(gòu)建的pUC-petBD載體上petB和petD之間是否引入HindIII酶切位點(diǎn), 設(shè)計(jì)了引物HindIII JD-F和HindIII JD-R(表2), 用該引物對(duì)pUC-petBD載體進(jìn)行擴(kuò)增, 理論產(chǎn)物大小為616 bp, 酶切位點(diǎn)位于第216個(gè)堿基處。圖2是對(duì)引入的酶切位點(diǎn)鑒定的電泳圖, PCR產(chǎn)物大小為600 bp左右, HindⅢ酶切后產(chǎn)生大約200 bp和400 bp的2個(gè)片段, 與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)吻合, 說明成功地在petB和petD之間引入了一個(gè)新的HindⅢ酶切位點(diǎn)。

    表1 構(gòu)建同源重組載體定點(diǎn)突變載體所需的引物Tab. 1 Primer sequences for the construction of the site-directed mutagenesis plasmid based on homologous recombination

    按照Transgen公司的Fast Mutagenesis System的操作, 以pUC-petBD質(zhì)粒為模板, 根據(jù)集胞藻Cyt b6f亞基IV的編碼序列分別設(shè)計(jì)引物(G-F、G-R; T-F、T-R; 表1),將petD的Gly136(GGC)突變成Ala(GCC)即單突Gly136Ala,Thr137(ACT)突變成Ala(GCT)即單突Thr137Ala。以及以單突Thr137Ala質(zhì)粒為模板, D-F和D-R(表1)為引物構(gòu)建雙突Gly136Ala/Thr137Ala。這三個(gè)定點(diǎn)突變的質(zhì)粒構(gòu)建完成, 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確(數(shù)據(jù)未顯示)。

    表2 PCR驗(yàn)證突變株所用的引物序列Tab. 2 Primer sequences for the identification by PCR

    圖1 同源重組載體pUC-petBD的構(gòu)建圖譜Fig. 1 Schematic describing the construction of the homologous recombinant vector pUC-pet BD

    圖2 HindⅢ酶切 pUC-petBD載體PCR產(chǎn)物的電泳分析Fig. 2 An electrophoretogram of HindⅢ-restricted from pUC-petBD vector

    2.2 集胞藻6803的轉(zhuǎn)化和Kanr突變株的篩選

    將測(cè)序正確的三個(gè)定點(diǎn)突變質(zhì)粒分別與野生型集胞藻6803細(xì)胞混合, 進(jìn)行轉(zhuǎn)化, 光照下孵育6h后, 涂布于不加卡那覆蓋有硝酸纖維素薄膜的BG-11固體培養(yǎng)基上, 生長(zhǎng)2—3d后, 將濾膜轉(zhuǎn)到含有25 μg/mL 的卡那霉素固體板上培養(yǎng)。同時(shí)以野生型6803作對(duì)照。大約1周后, 野生對(duì)照沒有長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子(圖3a), 而三個(gè)重組平皿分別長(zhǎng)出單菌落(圖3 b, c, d)。

    隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子, 在25 μg/mL的卡那霉素BG11固體平板上進(jìn)行抗性篩選, 通過 3—5次繼代篩選后, 以野生型集胞藻 6803和三個(gè)定點(diǎn)突變株的基因組為模板, 用K-F和K-R為引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明在野生型集胞藻6803中的PCR產(chǎn)物約為0.3 kb,而在篩選的12個(gè)突變株的PCR產(chǎn)物都為約1.7 kb, 多出了約1.4 kb的抗性基因Kanr(圖4)。這一結(jié)果表明, 在DNA水平上, 抗性基因已經(jīng)重組到了集胞藻中。

    2.3 定點(diǎn)突變株株的驗(yàn)證

    以野生型集胞藻 6803和 12個(gè)成功重組抗性基因Kanr的突變株基因組為模板, HindⅢJD-F和HindⅢJD-R (表2)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明, 野生和12個(gè)突變株都能擴(kuò)增出616 bp大小的DNA片段, 經(jīng)HindⅢ酶切后, 野生型6803的PCR產(chǎn)物片段不能被切開, 12個(gè)突變株中有5株P(guān)CR產(chǎn)物能夠切出約200 bp和約400 bp兩條帶, 其他 7株未被切開(圖 5)。這一結(jié)果表明, 上述 5株(其 PCR產(chǎn)物能被 HindⅢ酶切開的突變株), 上游同源序列的重組至少開始于petB和petD之間的HindⅢ酶切位點(diǎn), 在一般情況下, 其后的氨基酸突變位點(diǎn)也應(yīng)該重組到集胞藻的基因組中。

    圖3 在含25 μg/mL卡那霉素的BG-11固體板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子Fig. 3 Inducement of the transformants on BG-11 plate containing 25 μg/mL kanamycin (a) Wild type 6803; (b) Single mutant Gly136Ala; (c) Single mutant Thr137Ala; (d) Double mutant Gly136Ala/Thr137Ala

    圖4 鑒定突變株是否插入Kanr片段Fig. 4 Identification of the Kanrfragment insertion at DNA level

    圖5 鑒定突變株是否插入HindⅢ酶切位點(diǎn)Fig. 5 Identification of the Hind Ⅲ restriction site insertion at DNA level

    以上述5株突變株(3、4、7、11、12)和另外7株(1、2、5、6、8、9、10)為模板, 用測(cè)序引物petD-F和petD-R(表2), 擴(kuò)增 petD基因, 對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證, 結(jié)果表明上述5個(gè)突變株確實(shí)發(fā)生了定點(diǎn)突變(測(cè)序結(jié)果未顯示),其中3、4為單突G136A, 7為單突T137A, 11、12為雙突G136A/T137A。而在其他7株當(dāng)中, 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證只有1株發(fā)生了定點(diǎn)突變, 另外 6株并未發(fā)生定點(diǎn)突變(測(cè)序結(jié)果未顯示)。

    3 討論

    集胞藻是光合作用等研究領(lǐng)域常用的一種模式生物, 它具有天然的同源重組特性[1—3]。采用分子生物學(xué)方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行功能研究時(shí), 對(duì)于非必需基因, 無論是進(jìn)行基因敲除還是定點(diǎn)突變, 已經(jīng)有了大量的研究,方法已經(jīng)非常成熟[4—7]。但是對(duì)于編碼細(xì)胞色素 b6f 的亞基Ⅳ蛋白的petD必需基因進(jìn)行定點(diǎn)突變, 相關(guān)的研究報(bào)道不多。

    在同源重組載體上游區(qū)域或下游區(qū)域設(shè)計(jì)突變位點(diǎn),直接轉(zhuǎn)化集胞藻, 因?yàn)橹亟M的起始和終止位點(diǎn)難于確定,無法保證突變位點(diǎn)能夠與基因組發(fā)生重組, 如果盲目地對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序, 無疑會(huì)加大工作量和成本。但是如果在突變位點(diǎn)上游或下游(如果是突變位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒下游區(qū)域的情況)的非編碼區(qū)提前設(shè)計(jì)一個(gè)新的酶切位點(diǎn), 本實(shí)驗(yàn)中在Cyt b6亞基(petB編碼)和亞基Ⅳ(petD編碼)之間的非編碼區(qū)對(duì)一個(gè)堿基進(jìn)行突變, 形成一個(gè)新的HindⅢ的特異酶切位點(diǎn)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化子后, 擴(kuò)增該酶切位點(diǎn)上下游區(qū)域, PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切可以鑒定該酶切位點(diǎn)是否重組進(jìn)轉(zhuǎn)化子, 因?yàn)樵?HindⅢ酶切位點(diǎn)在petD基因的上游, 顯然如果這一位點(diǎn)重組進(jìn)了集胞藻基因組, 那么其下游的突變位點(diǎn)也應(yīng)該重組到野生 6803基因組中。因此在突變位點(diǎn)之前非編碼區(qū)引入特異酶切位點(diǎn),可以看作是第二個(gè)篩選標(biāo)記。

    在本實(shí)驗(yàn)中, 重組在引入的酶切位點(diǎn)之前發(fā)生的概率是比較高的, 實(shí)驗(yàn)挑選了12個(gè)轉(zhuǎn)化子, 其中 6個(gè)發(fā)生了定點(diǎn)突變, 其中有 5個(gè)鑒定為重組發(fā)生在引入的酶切位點(diǎn)之前, 這可能是與引入的酶切位點(diǎn)與突變位點(diǎn)距離較近和該酶切位點(diǎn)上游的同源序列較長(zhǎng)有關(guān)。上游同源序列總長(zhǎng)約1.7 kb, 引入的HindⅢ酶切位點(diǎn)約在1.0 kb的位置, 定點(diǎn)突變的位點(diǎn)約在1.4 kb的位置, 則酶切位點(diǎn)之前的同源區(qū)為約1.0 kb, 其與定點(diǎn)突變的位點(diǎn)相差約0.4 kb。即使這樣, 在實(shí)驗(yàn)中仍發(fā)現(xiàn)了雖然抗性基因 Kanr已經(jīng)重組到基因組中, 但是 HindⅢ酶切反應(yīng)成陰性, 并且測(cè)序也發(fā)現(xiàn)未發(fā)生定點(diǎn)突變的情況(挑選的12個(gè)轉(zhuǎn)化子中有6個(gè)屬于這種情況)。不難想象, 如果遇到突變位點(diǎn)(或者是引入的酶切位點(diǎn))之前的同源序列較短的情況, 這種方法的優(yōu)勢(shì)可能會(huì)更加顯著。因?yàn)樵谶@種情況下, 同源重組發(fā)生在突變位點(diǎn)下游的概率就會(huì)增加, 即突變位點(diǎn)的序列不發(fā)生同源重組, 那么利用突變位點(diǎn)之前引入的酶切位點(diǎn)為篩選標(biāo)記, 然后對(duì)酶切反應(yīng)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序, 這樣就避免了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的盲目性, 大大提高篩選的效率。

    綜上所述, 應(yīng)用本方法對(duì)petD這樣的必需基因進(jìn)行定點(diǎn)突變, 只需構(gòu)建一次質(zhì)粒, 進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化, 剩下的工作主要是應(yīng)用常規(guī)的PCR和酶切對(duì)抗生素平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證, 實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單。該方法不但克服了常規(guī)方法不能用來構(gòu)建必需基因定點(diǎn)突變的缺點(diǎn), 并且可以簡(jiǎn)單快速預(yù)篩選出定點(diǎn)突變株, 對(duì)其他必需基因定點(diǎn)突變的研究具有借鑒意義。

    [1] Yan C L, Xu X D. Isolation and characterization of mutants impaired in photoautotrophic growth in Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(2): 360—362 [閻春蘭, 徐旭東. 集胞藻 6803光合自養(yǎng)生長(zhǎng)突變株的篩選與鑒定. 水生生物學(xué)報(bào), 2009, 33(2): 360—362]

    [2] Fu J, Xu X D. A priA mutant of Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(1): 116—119 [付娟, 徐旭東. 集胞藻PCC6803priA 基因的突變體. 水生生物學(xué)報(bào), 2008, 32(1): 116—119]

    [3] Long Z J, Wang Q X, Ma W M, et al. Construction of the ndhO gene inactivation mutant of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 [J]. China Biotechnology, 2010, 30(9): 31—35 [龍宗娟, 王全喜, 馬為民, 等. 利用同源重組構(gòu)建藍(lán)藻集胞藻 6803ndhO基因突變株及其分子鑒定.中國(guó)生物工程雜志, 2010, 30(9): 31—35]

    [4] Gao H, Tang Q, Xu X D. Construction of copper-induced gene expression platform in Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(2): 240—244 [高宏,唐蜻, 徐旭東. 集胞藻 PCC6803銅離子誘導(dǎo)表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(2): 240—244]

    [5] Wang M, Shan J X, Kuang T Y, et al. Advances in the research of structure and function of photosystemⅡ core antenna complexes CP43 and CP47 [J]. Chinese Bulletin of Botany, 2000, 17(2): 141—149 [王梅, 單際修, 匡廷云, 等.光系統(tǒng)Ⅱ核心天線復(fù)合物CP43和CP47結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展. 植物學(xué)通報(bào), 2000, 17(2): 141—149]

    [6] Cindy Putnam-Evans, Jituo Wu, Terry M Bricker. Site-directed mutagenesis of the CP 47 protein of photosystem Ⅱ: alteration of conserved charged residues which lie within lethal deletions of the large extrinsic loop E [J]. Plant Molecular Biology, 1996, 32(6): 1191—1195

    [7] Cindy Putnam-Evans, Terry M Bricker. Site-directed mutagenesis of the CPa-1 protein of photosystem II: alteration of the basic residue pair384,385R to384,385G leads to a defect associated with the oxygen-evolving complex [J]. Biochemistry, 1992, 31: 11482—11488

    [8] Yan J, Dashdorj N, Cramer W A, et al. On the structural role of the aromatic residue environment of the chlorophyll a in the cytochrome b6f complex [J]. Biochemistry, 2008, 47(12): 3654—3661

    [9] Allen M M. Simple conditions for growth of unicellular blue-green algae on plates [J]. Journal of Phycology, 1968, 4(1): 1—4

    [10] Williams J G K. Construction of specific mutations in photosystem Ⅱ photosynthetic reaction center by genetic engineering method in Synechocystis 6803 [J]. Methods in Enzymology, 1988, 167: 766—778

    A RAPID METHOD FOR SITE-DIRECTED MUTAGENESIS OF THE ESSENTIAL GENE PETBD IN SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803

    LU Ya-Fei1, QU Na1, CHEN Xiao-Bo1and KUANG Ting-Yun2
    (1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Key Laboratory of Photobiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

    定點(diǎn)突變; pet BD必需基因; 酶切位點(diǎn); 集胞藻6803

    Site-directed mutagenesis; Pet BD essential gene; Restriction site; Synechocystis sp. PCC 6803

    Q784; Q-33

    A

    1000-3207(2014)05-0957-05

    10.7541/2014.141

    2013-07-01;

    2014-02-12

    國(guó)家“973”項(xiàng)目(2011CBA00901)資助

    蘆亞菲(1988—), 女, 河北石家莊人; 碩士生; 細(xì)胞色素b6f復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail: 630540631@qq.com

    陳曉波(1975—), 男, 河北邯鄲人; 博士; 主要從事細(xì)胞色素b6f復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail: zzschenxiaobo@163.com

    猜你喜歡
    酶切位點(diǎn)同源定點(diǎn)
    藥食同源
    ——紫 蘇
    兩岸年味連根同源
    例談圓錐曲線中的定點(diǎn)定值問題
    定點(diǎn)幫扶讓村民過上美好生活
    解析幾何中定點(diǎn)問題的處理策略
    以同源詞看《詩(shī)經(jīng)》的訓(xùn)釋三則
    基于兩種質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)蛋白酶酶切位點(diǎn)的方法
    直線過定點(diǎn)的5種特優(yōu)解法
    環(huán)狀定點(diǎn)誘變技術(shù)在載體構(gòu)建中的應(yīng)用
    2019新型冠狀病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位點(diǎn)
    国产精品一区二区免费欧美| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一级,二级,三级黄色视频| 国产亚洲av高清不卡| a在线观看视频网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日日夜夜操网爽| 久久久久国内视频| 91成人精品电影| 久久影院123| 久久人妻熟女aⅴ| 成年动漫av网址| 国产人伦9x9x在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 夜夜爽天天搞| 国产精品久久久人人做人人爽| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产av又大| 黄色成人免费大全| 视频在线观看一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 一级片免费观看大全| av视频免费观看在线观看| 成人永久免费在线观看视频 | 国产黄频视频在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 久久九九热精品免费| 男女无遮挡免费网站观看| e午夜精品久久久久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 色播在线永久视频| 国产精品成人在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 女同久久另类99精品国产91| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产色视频综合| 国产在线视频一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 精品国内亚洲2022精品成人 | 丝瓜视频免费看黄片| a级毛片黄视频| 青青草视频在线视频观看| 香蕉国产在线看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产不卡一卡二| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 老司机福利观看| 成人手机av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| av天堂在线播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产一区二区在线观看av| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩欧美三级三区| 又黄又粗又硬又大视频| 久久这里只有精品19| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 老汉色∧v一级毛片| 久久99热这里只频精品6学生| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久精品免费免费高清| 少妇粗大呻吟视频| 国产av国产精品国产| 国产男女内射视频| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲久久久国产精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美日韩黄片免| 国产成人精品久久二区二区免费| 日本vs欧美在线观看视频| 一夜夜www| 国产免费现黄频在线看| 亚洲国产看品久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品久久电影中文字幕 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 看免费av毛片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 超碰97精品在线观看| 不卡av一区二区三区| 咕卡用的链子| 国产激情久久老熟女| 大型av网站在线播放| 国产91精品成人一区二区三区 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 女同久久另类99精品国产91| 久久ye,这里只有精品| 91国产中文字幕| 精品久久久久久久毛片微露脸| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 丰满少妇做爰视频| 99久久精品国产亚洲精品| 成在线人永久免费视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜激情av网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩大片免费观看网站| 黄片大片在线免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美日韩黄片免| 男男h啪啪无遮挡| 国产亚洲欧美精品永久| 日本一区二区免费在线视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 1024香蕉在线观看| 成年版毛片免费区| 欧美国产精品一级二级三级| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品免费一区二区三区在线 | 黄频高清免费视频| 热99久久久久精品小说推荐| 18禁观看日本| 99国产精品一区二区三区| 国产精品电影一区二区三区 | 在线看a的网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲精品一二三| 亚洲国产看品久久| 黄色 视频免费看| 激情在线观看视频在线高清 | 国产黄色免费在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| av天堂在线播放| 午夜两性在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 中文欧美无线码| 91av网站免费观看| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲全国av大片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日本av手机在线免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 蜜桃在线观看..| videos熟女内射| 国产精品久久久久久精品电影小说| 夫妻午夜视频| svipshipincom国产片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲第一av免费看| 午夜精品国产一区二区电影| 老司机在亚洲福利影院| 大片免费播放器 马上看| 看免费av毛片| 国产高清videossex| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美日韩视频精品一区| 中亚洲国语对白在线视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 五月开心婷婷网| 五月开心婷婷网| 久久人人97超碰香蕉20202| 9热在线视频观看99| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜福利免费观看在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲情色 制服丝袜| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲精品国产区一区二| 夫妻午夜视频| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 正在播放国产对白刺激| 黄频高清免费视频| 久久久精品区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 人妻 亚洲 视频| 久久 成人 亚洲| 悠悠久久av| 久久精品亚洲av国产电影网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久亚洲精品不卡| 日韩欧美国产一区二区入口| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品国产亚洲在线| 麻豆成人av在线观看| 久久久久网色| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产97色在线日韩免费| 亚洲免费av在线视频| 婷婷丁香在线五月| 一区在线观看完整版| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 69av精品久久久久久 | 免费不卡黄色视频| 国产成人av教育| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人精品久久二区二区91| 交换朋友夫妻互换小说| 99久久国产精品久久久| 亚洲免费av在线视频| 免费av中文字幕在线| av国产精品久久久久影院| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲中文字幕日韩| 国产亚洲精品第一综合不卡| 宅男免费午夜| 18禁美女被吸乳视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久久国产一区二区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 在线 av 中文字幕| 悠悠久久av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品久久久久成人av| 午夜两性在线视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 九色亚洲精品在线播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费在线观看日本一区| 国产在视频线精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 免费在线观看日本一区| 黄色视频,在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 中文字幕精品免费在线观看视频| 水蜜桃什么品种好| 亚洲成人手机| 国产高清国产精品国产三级| 国产99久久九九免费精品| 黄色怎么调成土黄色| 精品第一国产精品| 一级片'在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜精品国产一区二区电影| 久热爱精品视频在线9| 国产精品一区二区免费欧美| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲专区字幕在线| 两个人看的免费小视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产区一区二久久| av福利片在线| cao死你这个sao货| 亚洲九九香蕉| 黄片小视频在线播放| 好男人电影高清在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品成人在线| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 十八禁网站免费在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看 | 久久免费观看电影| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黄片小视频在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 99国产精品免费福利视频| 国产在线视频一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 99re6热这里在线精品视频| 丝袜喷水一区| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄色 视频免费看| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩免费av在线播放| 动漫黄色视频在线观看| 蜜桃国产av成人99| 中文字幕制服av| 99久久人妻综合| 久久精品国产a三级三级三级| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 精品卡一卡二卡四卡免费| 男男h啪啪无遮挡| 99久久99久久久精品蜜桃| 91九色精品人成在线观看| 不卡av一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 精品高清国产在线一区| 在线观看舔阴道视频| 一本综合久久免费| 一本综合久久免费| 中文字幕高清在线视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 波多野结衣一区麻豆| 69精品国产乱码久久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人精品在线电影| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 女性被躁到高潮视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产高清videossex| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 男女免费视频国产| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美午夜高清在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美黑人精品巨大| 国产精品国产av在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 在线永久观看黄色视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 黄色丝袜av网址大全| 成人国语在线视频| 最新在线观看一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 欧美在线一区亚洲| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久精品成人免费网站| 亚洲天堂av无毛| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美日韩一级在线毛片| 国产成人av教育| 极品人妻少妇av视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 最黄视频免费看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产成人精品久久二区二区免费| 99九九在线精品视频| 成年人午夜在线观看视频| 岛国在线观看网站| 欧美精品亚洲一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99国产精品一区二区三区| 久久青草综合色| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久精品国产综合久久久| 国产亚洲精品一区二区www | 99久久国产精品久久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 女人精品久久久久毛片| 精品欧美一区二区三区在线| 多毛熟女@视频| 国产高清国产精品国产三级| 天堂8中文在线网| 成人精品一区二区免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 老司机亚洲免费影院| 老汉色av国产亚洲站长工具| 18禁国产床啪视频网站| 久久av网站| 在线天堂中文资源库| 99在线人妻在线中文字幕 | 国精品久久久久久国模美| 99九九在线精品视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 另类精品久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产高清激情床上av| 岛国毛片在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久av网站| 久久午夜亚洲精品久久| 大码成人一级视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国精品久久久久久国模美| 精品国产国语对白av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 两个人看的免费小视频| √禁漫天堂资源中文www| 日日夜夜操网爽| 一本综合久久免费| 天堂俺去俺来也www色官网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品国产国语对白av| 久久久久久久久免费视频了| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产成人av教育| 精品久久久久久电影网| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产成人免费观看mmmm| 欧美成人免费av一区二区三区 | 亚洲综合色网址| 成人影院久久| 大型av网站在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 国产男女超爽视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费在线观看黄色视频的| 中文字幕人妻丝袜制服| 大香蕉久久成人网| 最新美女视频免费是黄的| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产高清激情床上av| 极品教师在线免费播放| 日韩大码丰满熟妇| 免费在线观看黄色视频的| 高清av免费在线| 大码成人一级视频| av国产精品久久久久影院| 一级a爱视频在线免费观看| 午夜精品国产一区二区电影| av在线播放免费不卡| 五月开心婷婷网| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一区二区三区乱码不卡18| 在线观看66精品国产| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美黑人欧美精品刺激| 人成视频在线观看免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 午夜老司机福利片| 久久热在线av| 一区二区三区激情视频| 人妻一区二区av| 在线天堂中文资源库| 亚洲五月婷婷丁香| 美女扒开内裤让男人捅视频| 色综合婷婷激情| 十八禁高潮呻吟视频| 丝袜在线中文字幕| 色尼玛亚洲综合影院| 国产av国产精品国产| netflix在线观看网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99精品欧美一区二区三区四区| 69av精品久久久久久 | 国产成人av教育| 黄色丝袜av网址大全| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99在线人妻在线中文字幕 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品乱码久久久久久99久播| 一级片免费观看大全| 成人三级做爰电影| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产成人欧美| 啦啦啦 在线观看视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 人人澡人人妻人| 丁香六月欧美| 蜜桃国产av成人99| av视频免费观看在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久久网色| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| tocl精华| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲 国产 在线| 欧美 日韩 精品 国产| 在线天堂中文资源库| 69精品国产乱码久久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 老汉色∧v一级毛片| 日本五十路高清| 欧美午夜高清在线| 亚洲黑人精品在线| 国产色视频综合| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产成人av激情在线播放| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 91成人精品电影| 国产精品九九99| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 在线观看免费高清a一片| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 免费黄频网站在线观看国产| 十八禁网站免费在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久久久久久久免费视频了| 老司机在亚洲福利影院| www.自偷自拍.com| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲国产av新网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲 国产 在线| kizo精华| 亚洲黑人精品在线| 精品久久蜜臀av无| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲精华国产精华精| a在线观看视频网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | avwww免费| 午夜视频精品福利| 精品视频人人做人人爽| 18禁美女被吸乳视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 免费看a级黄色片| 免费观看人在逋| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲专区字幕在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 香蕉国产在线看| 窝窝影院91人妻| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲男人天堂网一区| 一级,二级,三级黄色视频| 成人三级做爰电影| 免费日韩欧美在线观看| 天天影视国产精品| 久久免费观看电影| 午夜成年电影在线免费观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 久热这里只有精品99| 两性夫妻黄色片| 十分钟在线观看高清视频www| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 啦啦啦 在线观看视频| 最新在线观看一区二区三区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91av网站免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品成人在线| 一区二区三区国产精品乱码| 无遮挡黄片免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜免费鲁丝| 国产日韩欧美在线精品| 欧美精品一区二区大全| 高清在线国产一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 91九色精品人成在线观看| 亚洲美女黄片视频| 国产成人精品久久二区二区91| 色尼玛亚洲综合影院| 老汉色∧v一级毛片| 成人亚洲精品一区在线观看| 大码成人一级视频| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产精品免费视频内射| 欧美变态另类bdsm刘玥| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 又黄又粗又硬又大视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 成人手机av| 男男h啪啪无遮挡| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产一区二区激情短视频| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品影院久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 最新在线观看一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 91av网站免费观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 不卡av一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 99re6热这里在线精品视频| 一区二区三区精品91| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 人人妻人人澡人人看| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲人成77777在线视频| 极品人妻少妇av视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久国产精品大桥未久av| 中亚洲国语对白在线视频| av国产精品久久久久影院| 老熟女久久久| 日韩视频一区二区在线观看| 99热网站在线观看| 国产精品久久久久成人av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 免费看十八禁软件| 亚洲 欧美一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品欧美亚洲77777| 国产亚洲av高清不卡| 在线天堂中文资源库| 成人国语在线视频| 在线观看免费高清a一片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 青草久久国产| 一级毛片精品| 999久久久精品免费观看国产| 丝袜喷水一区| 国产成人影院久久av| 色播在线永久视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 99re在线观看精品视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产成人av教育| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看|