諾如病毒的研究進(jìn)展

吳 瓊，何玉林

諾如病毒性疾病又被稱為冬季嘔吐性疾病、胃腸性流感等，是由諾如病毒(Norovirus，NoV)引起的，可感染人和動(dòng)物引起急性腸胃炎，于1968 年在美國俄亥俄州諾瓦克(Norwalk)鎮(zhèn)暴發(fā)，1972 年美國學(xué)者Kapikian 首先用免疫電鏡技術(shù)從1968 年暴發(fā)的胃腸炎患者樣本中檢出了病原，定名為諾如病毒[1]。無論在發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家，從兒童到成年人都受到諾如病毒的感染，并可造成暴發(fā)流行，成為影響人類健康的不可忽視的問題?？茖W(xué)家把每次流行中找到的病毒按照地名依次命名為夏威夷病毒(Hawaii Virus 1977)、蒙哥馬利病毒(Montgomery County Virus1977)、馬林病毒(Marin County Virus 1981)、雪山病毒(Snow mountain Virus 1988)等，統(tǒng)稱為諾如病毒。

諾如病毒歸屬于嵌杯病毒科(Caliciviridae)諾瓦克樣病毒屬(Norwalk-like virus)，是一種單鏈RNA病毒，無囊膜，直徑大約27～32 nm。諾如病毒含有40多種不同的病毒株，根據(jù)其基因特征，主要分為6個(gè)基因型，GI到GⅥ，其中GI、GII和GIV基因型主要感染人類[2-3]，而GIII 和GV 可感染豬、牛和鼠[4]。依據(jù)病毒衣殼蛋白(VP1)序列和RNA 依賴的RNA 聚合酶多態(tài)性的配對(duì)分布，每個(gè)基因型可進(jìn)一步分為不同的基因亞型，GI有8個(gè)基因亞型，GII有至少17個(gè)，其中基因型GII，亞型4 的諾如病毒(GII.4)，占目前全世界流行的諾如病毒的70%～80%，主要引發(fā)人感染病毒性腸胃炎，GII.4可通過定期的點(diǎn)突變或基因重組積累而產(chǎn)生新毒株，表現(xiàn)出基因/抗原的多樣化[5]，幾乎是每隔兩三年便會(huì)出現(xiàn)新的變異株，從而引發(fā)大的流行[6]。

1 病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能

基因組長約為7.5 kb，由3個(gè)開放閱讀框(openreading frame, ORF)組成(圖1-a)，通過生物信息學(xué)手段在一些鼠諾如病毒中發(fā)現(xiàn)了第4個(gè)ORF的存在[7]。病毒的5′共價(jià)結(jié)合Vpg，據(jù)推測，Vpg 的作用是把病毒基因組轉(zhuǎn)運(yùn)到負(fù)鏈RNA 合成的部位?；蚪M的3′末端含有polyA 尾。ORF1 為長約5 kb 的非結(jié)構(gòu)蛋白，編碼一個(gè)約200 kD 的多聚蛋白，被病毒編碼的蛋白酶切割后產(chǎn)生6 個(gè)小蛋白，從N端到C端依次是：N 末端蛋白、NTPase (核苷磷酸酶)、p22(3A樣蛋白)、VPg(與病毒基因組共價(jià)結(jié)合)、Pro (3C 樣蛋白酶)、Pol (RNA 依賴的RNA 聚合酶)[8]。ORF2 和ORF3 編碼結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2 長約1.8 kb，編碼57 kD 的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1；ORF3 長約0.6 kb，編碼一個(gè)22 kD 的強(qiáng)堿性微小結(jié)構(gòu)蛋白，可能與基因組包裝成病毒體有關(guān)。

圖1 病毒基因組結(jié)構(gòu)和衣殼蛋白結(jié)構(gòu)域[8]

諾如病毒的衣殼蛋白由180 個(gè)分子組成，折疊成90 個(gè)二聚體，構(gòu)成了T=3 的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。衣殼蛋白分為2 個(gè)主要的區(qū)：外殼區(qū)(S區(qū))和突出區(qū)(P區(qū))，兩者通過靈活的鉸鏈相連。S 區(qū)主要涉及到二十面體外殼的形成，形成了一個(gè)光滑的病毒基因組外殼，無法與受體結(jié)合[9]。P 區(qū)從外殼向外形成突起部分，P 區(qū)二聚化在衣殼表面上形成拱狀突起結(jié)構(gòu)，包含受體結(jié)合區(qū)域，進(jìn)一步可分為P1(拱干)和P2(拱頂)，P2是最可變區(qū)(圖1-b)，包含碳水化合物結(jié)合序列和血型組織抗原結(jié)合序列[10]。GII.4型病毒的P2結(jié)構(gòu)域包含了高變的抗原表位A-E，與變異株的流行密切相關(guān)[11]。這說明此區(qū)域含有株特異性決定簇、受體結(jié)合位點(diǎn)以及潛在的中和抗體結(jié)合位點(diǎn)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

鼠諾如病毒能在細(xì)胞培養(yǎng)物和小動(dòng)物中復(fù)制，又因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室利用小鼠研究的低成本和可操作性，使得小鼠成為研究諾如病毒生物學(xué)和致病機(jī)理的模式動(dòng)物[12-13]。鼠諾如病毒可體外感染鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)、鼠BV-2細(xì)胞系和其它的鼠源細(xì)胞系，產(chǎn)生典型的CPE[14]。利用基因工程手段，將鼠諾如病毒全長cDNA克隆到牛痘病毒載體MVA-T7(具有T7啟動(dòng)子)中轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，可檢測到病毒蛋白的表達(dá)和RNA的復(fù)制[15]。在雞痘病毒中(FWPV)利用T7RNA聚合酶也能拯救出M諾如病毒[16]。最近研究發(fā)現(xiàn)人諾如病毒可在肝癌細(xì)胞系(Huh-7)中穩(wěn)定復(fù)制、表達(dá)并釋放病毒粒子[17]。Timothy M等設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有旋轉(zhuǎn)管的生物反應(yīng)器(RWV)，利用膠原包被的多孔微載體珠在三維空間中模擬體內(nèi)器官和組織的環(huán)境，將人諾如病毒接種胚胎腸上皮細(xì)胞系(INT-407)，為人和諾如病毒之間相互作用的研究提供平臺(tái)，使其能更真實(shí)的反映體內(nèi)病毒與宿主的關(guān)系[18]。杯狀病毒科的水泡狀病毒可在細(xì)胞培養(yǎng)中很好的生長，并能在亞基因區(qū)產(chǎn)生一種獨(dú)特的衣殼蛋白的前導(dǎo)蛋白(LC)，可見其與水泡病毒在細(xì)胞中的復(fù)制有關(guān)，因此推測LC蛋白可能也與其它杯狀病毒在細(xì)胞中的有效復(fù)制有關(guān)，基于這樣的假設(shè)，Kyeong-Ok Chang等[19]構(gòu)建了帶有綠色熒光標(biāo)記的全長諾如病毒載體p諾如病毒-GFP，將貓杯狀病毒的LC基因區(qū)域構(gòu)建到牛痘病毒MVA-T7，使其表達(dá)杯狀病毒的LC蛋白，共感染細(xì)胞后，可檢測到GFP信號(hào)細(xì)胞量的增加，對(duì)照為p諾如病毒-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，因此推測LC可能是諾如病毒在細(xì)胞中復(fù)制的增強(qiáng)子。

3 組織嗜性

在利用病毒樣顆粒研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，杯狀病毒的一個(gè)共同特征是可結(jié)合到多種形態(tài)的糖復(fù)合物上(鞘脂糖類，糖蛋白或多聚糖)。許多人類諾如病毒和血型組織抗原HBGAs結(jié)合，而鼠諾如病毒可結(jié)合到神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸上。人對(duì)諾如病毒的易感性也呈現(xiàn)出多樣性，有些人群是諾如病毒的高度易感群，有些人群則可以抵抗病毒的感染，α-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT2)的表達(dá)是決定諾如病毒的易感性所必須的，取決于上皮細(xì)胞是否存在海藻糖，F(xiàn)UT2過量表達(dá)可增加病毒對(duì)細(xì)胞的吸附[20-21]，這也許是因?yàn)镕UT2可在腸上皮細(xì)胞催化產(chǎn)生海藻糖。

鼠諾如病毒易感染鼠源巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞，但不能感染人源或其它動(dòng)物源的巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞[13]。對(duì)于許多病毒，細(xì)胞吞噬和酸性內(nèi)涵體內(nèi)的低pH是病毒感染的關(guān)鍵，如在貓嵌杯病毒FCM中研究發(fā)現(xiàn)，其可通過網(wǎng)格蛋白途徑介導(dǎo)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)吞作用[22]。鼠諾如病毒(M諾如病毒)感染巨噬細(xì)胞則不需要網(wǎng)格蛋白途徑，提高胞內(nèi)體的pH也不會(huì)抑制感染，但其感染可被β-甲基環(huán)糊精和肌動(dòng)蛋白抑制劑(dynasore)抑制，推測M諾如病毒的感染不依賴網(wǎng)格蛋白和pH途徑，依賴于肌動(dòng)蛋白和膽固醇途徑[12]。鼠諾如病毒不能與HBGAs結(jié)合，巨噬細(xì)胞表面表達(dá)GD1a, GM1和GA1，利用基因敲除手段發(fā)現(xiàn)鼠諾如病毒只可與神經(jīng)節(jié)糖苷(GD1a)結(jié)合，不能結(jié)合GM1和GA1，這也就表明病毒與GD1a結(jié)合的最小的表位應(yīng)該是唾液酸[23]。在GT1b上存在唾液酸表位，經(jīng)ELISA驗(yàn)證其能與病毒結(jié)合[24]。通常情況下鼠感染諾如病毒都沒有臨床癥狀，然而當(dāng)感染免疫缺陷小鼠(RAG2/STAT1-/-)時(shí)，可誘導(dǎo)致死性胃腸炎[25]。Chang等利用反向遺傳系統(tǒng)[26]研究發(fā)現(xiàn)IFN-α和IFN-γ可在體外抑制諾如病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出劑量依賴型。在體外和體內(nèi)，分別觀察到了鼠諾如病毒對(duì)IFN的敏感性[27]。反向遺傳系統(tǒng)可為諾如病毒基因功能及抗病毒研究提供更有力的方法，從基因水平提供了研究病毒與宿主相互作用的方法，這也可為抗病毒藥物的研發(fā)提供新思路。

4 流行病學(xué)

目前報(bào)道的諾瓦克樣病毒主要來源于海水產(chǎn)品，諾如病毒通常棲息于牡蠣等貝類中，人若生食這些受污染的貝類會(huì)被感染。諾如病毒的傳染源為感染的患者、隱性感染者及健康攜帶者。以手-糞-口為主，其次是直接接觸傳染，或是因前述癥狀產(chǎn)生的飛沫污染物體表面后間接感染。諾如病毒在半封閉的環(huán)境中和人口集中的地區(qū)容易暴發(fā)，多在寒冷的冬季發(fā)病，所以被稱為冬季嘔吐癥。還有一些因素可影響諾如病毒的暴發(fā)，比如病毒粒子的高感染性，在環(huán)境中的持續(xù)存在，感染的患者、隱性感染者的排毒和缺乏持久的免疫力等因素。

人與猩猩是該病毒GI、GII 和GIV 3 個(gè)基因型的易感宿主，豬、牛和鼠是GIII 和GV的易感宿主，諾如病毒呈現(xiàn)出廣泛的遺傳變異性，根據(jù)全長衣殼蛋白序列的相似性及進(jìn)化樹分析，每個(gè)基因型又可分為不同的基因亞型。其6個(gè)基因型之間的病毒衣殼蛋白基因的變異為45%～61%，而人類諾如病毒的變異可達(dá)57%。同一基因型內(nèi)不同病毒株的病毒衣殼蛋白序列具有較高的同源性，為69%～97%，而不同基因型的病毒株只有51%～56%。以GII.4 為例，其6 個(gè)不同的亞型的核苷酸變異在2%左右，一般說來，GII.4 的變異大約為10%[28]。這種屬內(nèi)的差異甚至要比其它負(fù)鏈RNA病毒家族屬間的差異還要大，這毋庸置疑的成為了限制諾如病毒免疫保護(hù)的最重要的原因。大多數(shù)的研究都認(rèn)為同一基因組內(nèi)的不同基因型具有相似的抗原性，但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，一些GII.4基因型的進(jìn)化導(dǎo)致產(chǎn)生配體改變和抗原變異的新毒株[28]。免疫壓力以及HBGA- 受體相互作用可能促進(jìn)衣殼蛋白P2 區(qū)末端和暴露的P1 區(qū)殘基的進(jìn)化，導(dǎo)致衣殼蛋白結(jié)構(gòu)的變化，并產(chǎn)生新的亞型。重組病毒的快速出現(xiàn)從另一角度表明次要衣殼蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒進(jìn)化中也起著非常重要的作用。

諾如病毒不同基因型之間的基因組重組頻繁發(fā)生[29]，這已成為諾如病毒進(jìn)化基因多樣性的主要策略和動(dòng)力，也影響其進(jìn)化分型，混淆分子流行病學(xué)研究，并影響疫苗的設(shè)計(jì)。諾如病毒基因相當(dāng)大的可變性，對(duì)于病毒的生存是十分有利的。還不清楚其基因多態(tài)性的快速進(jìn)化是由于免疫壓力，還是由于易于出錯(cuò)的聚合酶及進(jìn)行重組的能力使得RNA 病毒經(jīng)歷快速的基因漂移。反向遺傳系統(tǒng)為諾如病毒的變異和進(jìn)化研究提供了更有力的方法，在基因水平提供了研究病毒與宿主相互作用的方法。

用人諾如病毒GII.4感染SPF豬和牛，以小鼠感染鼠諾如(M諾如病毒-1)病毒為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)人GII.4可感染SPF豬和牛，可檢測到病毒的復(fù)制和血清陽性[30]，這說明諾如病毒存在從動(dòng)物與人之間傳播的可能性，諾如病毒的預(yù)防和控制必須要考慮到這一點(diǎn)。在小狗和幼獅中發(fā)現(xiàn)的GIV型諾如病毒，以及在狗中發(fā)現(xiàn)的GVI型諾如病毒均揭示在遺傳上相關(guān)的病毒可能會(huì)在更多的其它物種中發(fā)現(xiàn)[31-32]。目前，還沒有相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證諾如病毒是否存在宿主范圍擴(kuò)大的證據(jù)，但寵物的感染將對(duì)人類的健康造成巨大的威脅。人體內(nèi)可檢測到GIV型諾如病毒的抗體[33]，這也初步證實(shí)諾如病毒存在寵物與人之間的傳播。病毒從人到動(dòng)物的傳播或是從動(dòng)物到人的傳播所帶來的威脅是無法估量的，目前還沒有在人類中發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的諾如病毒，但是在人體內(nèi)可檢測到動(dòng)物諾如病毒的抗體，在豬體內(nèi)也檢測到了人諾如病毒的抗體；在雙殼貝類中發(fā)現(xiàn)了人的諾如病毒，可與動(dòng)物的諾如病毒同時(shí)存在，這都為人們提示諾如病毒在人與動(dòng)物之間傳播的危險(xiǎn)性，為預(yù)防該病的暴發(fā)提出了新的挑戰(zhàn)。

5 病毒的感染機(jī)制

人感染諾如病毒后，分析腸近端活組織切片發(fā)現(xiàn)完整的腸粘膜有特異性的組織變化，包括絨毛的擴(kuò)大和鈍化，微絨毛縮短，線粒體變大，胞漿空泡化，細(xì)胞間水腫。電鏡分析，這些細(xì)胞形態(tài)仍然是完整的。除了腸的變化，諾如病毒感染人類后還會(huì)在粘膜固有層產(chǎn)生微弱的炎癥反應(yīng)，十二指腸的上皮細(xì)胞毒性T細(xì)胞有所增加[34]。諾如病毒可引起的人類、豬、和鼠腸細(xì)胞的凋亡，體外表達(dá)ORF1的多聚蛋白便可足以誘導(dǎo)健康細(xì)胞的凋亡[35]，主要是通過下調(diào)表達(dá)生存蛋白(survivin)，激活caspase-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。小鼠杯狀病毒和貓杯狀病毒已被證明在體外通過線粒體途徑導(dǎo)致受感染的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡，而體內(nèi)細(xì)胞凋亡可能是由于受感染的直接影響[36]。Troeger等推測，諾如病毒感染時(shí)上皮細(xì)胞內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞的涌入可能會(huì)導(dǎo)致在釋放穿孔蛋白后腸囊腫細(xì)胞的凋亡[34]。因此，諾如病毒引起的腸上皮細(xì)胞凋亡存在直接和間接的機(jī)制。

以往認(rèn)為諾如病毒的感染都被局限在腸部位，但最近的幾項(xiàng)研究表明，情況并非如此。在感染的個(gè)體15%可在血清中檢測到諾如病毒RNA[37]。在動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，病毒的傳播可穿過腸部位。SPF牛感染諾如病毒后有50%的可出現(xiàn)短暫的病毒血癥，20%可在血清中檢測到諾如病毒RNA[37]。鼠諾如病毒可通過感染DC細(xì)胞，傳播至引流淋巴結(jié)，感染腸系膜淋巴結(jié)和周邊組織，并可在脾臟有效地復(fù)制，導(dǎo)致脾臟病變。目前對(duì)諾如病毒的感染、致病機(jī)制，物種與組織嗜性，病毒與宿主相互作用，靶細(xì)胞受體，在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程等基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，這也嚴(yán)重阻礙了人們對(duì)該病毒的認(rèn)識(shí)，未來的研究期望能在致病機(jī)理上有較大突破。

6 檢測技術(shù)

目前實(shí)驗(yàn)室諾如病毒檢測有3種方法: 電鏡法； 免疫學(xué)方法； 分子生物學(xué)方法。

6.1電鏡法 取發(fā)病后24～48 h 大便作免疫電鏡檢查，可見病毒顆粒，但因?yàn)橹Z如病毒缺乏典型的杯狀病毒特征，而且常因病毒量少而難以發(fā)現(xiàn)。

6.2免疫學(xué)方法 免疫學(xué)方法包括放射免疫法(RIA)、生物素- 親和素免疫法(Biotin- Avidin Imunoassy)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。RIA 靈敏度比IEM法可提高10～100 倍，可檢測出抗體消長的水平。不足之處在于耗時(shí)長，且需要放射性同位素標(biāo)記。為了簡化方法，美國疾病預(yù)防控制中心建立了生物素—親和素免疫法，其靈敏度與RIA法相當(dāng)。以抗重組衣殼超免抗血清為基礎(chǔ)的捕獲ELISA 技術(shù)已經(jīng)問世多年，現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)。李瀟[38]等以E.coli表達(dá)的GII組廣州株NV全長衣殼蛋白作為免疫原，免疫BALB /c小鼠并制備mAb，E.coli表達(dá)系統(tǒng)操作簡便，重組蛋白產(chǎn)量高，并且可以使用配套純化方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行高度純化為研制諾如病毒檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。使用單克隆抗體(mAb)捕獲患者糞便標(biāo)本中的病毒抗原來進(jìn)行檢測的方法(夾心ELISA)由于交叉反應(yīng)性小，特異性較強(qiáng)且敏感度較高，成為目前研制諾如病毒檢測試劑所主要采用的方法。

6.3分子生物學(xué)檢測技術(shù) RT-PCR已廣泛應(yīng)用于諾如病毒的檢測, 成為諾如病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，敏感性及特異性均較好。多重RT-PCR 能同時(shí)診斷諾如病毒, 星狀病毒和輪狀病毒。尤其對(duì)于低濃度的諾如病毒感染，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行基因型的研究，不會(huì)受到獲得分型單克隆抗體的限制，對(duì)流行病學(xué)研究具有重要意義。陳宗峰[15]等建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，它能夠識(shí)別靶DNA 上6 個(gè)特定區(qū)域的4 條引物和一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡便等特點(diǎn)，與RT-PCR技術(shù)相比，RT-LAMP法更加簡便快速，能夠在等溫條件下進(jìn)行，特異性好,具有更高的靈敏性。但諾如病毒相當(dāng)高的變異性使得開發(fā)針對(duì)所有變異株的檢測方法很困難。

諾如病毒基因型復(fù)雜，不同型別的序列變化大，大多數(shù)檢測方法只能針對(duì)一種或幾種型別進(jìn)行檢測，這在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。因此，研究出能夠靈敏、特異地檢測所有型別諾如病毒的方法具有較大意義。Thongprachum等最近研究出了免疫層析試劑盒(IC-kit)可用于從患者糞便樣品中快速檢測諾如病毒，其與RT-PCR相比靈敏度為74.2%、特異性99.5%和結(jié)果的一致性96.1%?；贜oV的系統(tǒng)進(jìn)化分析，其能檢測出NoV GII/3， GII/4，GII/6，GII/13， GII/15，和GII/16 基因型，因?yàn)槠涫褂玫氖嵌嗫寺】贵w，因此可同時(shí)用于檢測更寬范圍的型別[39]。檢測技術(shù)的發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)NoV傳播特點(diǎn)、分布規(guī)律與分子進(jìn)化機(jī)制的研究具有重要意義。同時(shí)，PCR技術(shù)還促進(jìn)了NoV序列的積累，這不但有助于了解病毒基因組特征，而且還加深了對(duì)其進(jìn)化機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

7 疫苗研究進(jìn)展

目前認(rèn)為諾如病毒抗體沒有明顯的保護(hù)作用，尤其是長期免疫作用。研究表明，GI型病毒之間存在廣泛的抗體交叉反應(yīng)，而遺傳學(xué)上相似的GII型病毒由于其抗原的高度變異而表現(xiàn)出較低的交叉保護(hù)[40]，這也嚴(yán)重抑制了諾如病毒疫苗的研制，尤其是對(duì)于人群中暴發(fā)流行的GII.4型毒株。同時(shí)，人類諾如病毒短期免疫的表現(xiàn)也是復(fù)雜的，即使在兒童時(shí)期感染過諾如病毒，有些健康的成人中諾如病毒的發(fā)病率和感染率仍然較高。很顯然，諾如病毒感染后僅產(chǎn)生有限的短期免疫力，但對(duì)于人類諾如病毒感染和發(fā)病后的免疫力的研究仍然很有限。雖然人和鼠諾如病毒的細(xì)胞培養(yǎng)已取得了一定的進(jìn)展，但迄今尚無病毒疫苗問世，阻礙諾如病毒疫苗發(fā)展的一個(gè)重要原因是病毒的高度異質(zhì)性。

目前，諾如病毒疫苗的研究主要集中于在各種系統(tǒng)中表達(dá)衣殼蛋白，因?yàn)橐職さ鞍卓勺越M裝為病毒樣顆粒(VLP)，能模擬真實(shí)病毒粒子的抗原結(jié)構(gòu)，耐酸，耐熱，具有抗原性和免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，主要為血清IgG 和 粘膜IgA反應(yīng)。在各種系統(tǒng)中包括昆蟲，動(dòng)物和植物系統(tǒng)表達(dá)病毒VP1產(chǎn)生的病毒樣顆粒(VLPs)的抗原性和形態(tài)特征等天然病毒粒子相似。用從昆蟲和植物體系中產(chǎn)生的諾如病毒-VLPs經(jīng)口服方式免疫小鼠，可刺激產(chǎn)生系統(tǒng)性和粘膜的諾如病毒抗體，諾如病毒-VLPs鼻內(nèi)注射也具有高免疫原性，能以較低的劑量刺激產(chǎn)生系統(tǒng)性和粘膜的諾如病毒抗體，口服和鼻內(nèi)注射都可在遠(yuǎn)端粘膜部位產(chǎn)生抗體[41]。這表明諾如病毒-VLPs可遞呈通過基因融合手段產(chǎn)生的異源多肽抗原。Guo 等[42]利用重組腺病毒系統(tǒng)表達(dá)諾如病毒衣殼蛋白經(jīng)鼻免疫小鼠，也獲得了較好的體液免疫、黏膜免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，這為諾如病毒疫苗的研究提供了新的思路。戊型肝炎病毒(HEV)疫苗的問世也為諾如病毒疫苗的研制提供了良好的平臺(tái)，它們都屬于腸溶性傳播的病毒，并且都具有相似的由表面衣殼蛋白P結(jié)構(gòu)域二聚體的突出結(jié)構(gòu)，以此設(shè)計(jì)出的嵌合雙價(jià)疫苗，將諾如病毒的P端融合到HEV的P端，原核表達(dá)NoV P--HEV P融合蛋白，免疫小鼠后可產(chǎn)生高滴度的中和抗體[43]。近年來，隨著生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，科學(xué)家們可通過計(jì)算機(jī)模擬來預(yù)測GII.4的分子進(jìn)化規(guī)律，并以此為背景，將不同毒株GII.4的抗原決定簇嵌合表達(dá)出VLP[44]，顯示出對(duì)不同毒株GII.4廣泛的保護(hù)效果，其效果比多價(jià)GII.4混合疫苗更顯著，有望用于人群中諾如病毒的暴發(fā)和控制。

8 小 結(jié)

最新的研究發(fā)現(xiàn)，諾如病毒作為食源性的胃腸道病原體，正在取代主要引發(fā)兒童胃腸道疾病的輪狀病毒而成為最主要的人類胃腸道疾病的病原體[45]，其在世界范圍內(nèi)的流行和暴發(fā)是與諾如病毒的持續(xù)存在及其不斷變異和進(jìn)化密切相關(guān)的。GII.4仍然是全球的優(yōu)勢基因型，并在2012年出現(xiàn)了新的變種，稱為Sydney 2012。重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)以及在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用也為動(dòng)物傳染病的診斷提供了新的方法，因?yàn)橹亟M的抗原缺乏宿主的胞內(nèi)蛋白，可以大大降低假陽性反應(yīng)發(fā)生率，提高了快速性，特異性和各種診斷檢測的靈敏度。作為一種新的診斷方法，以期能夠用于諾如病毒的檢測。

由于諾如病毒基因組內(nèi)和基因型之間的高度變異，使得疫苗無法交叉保護(hù)，VLP 可以作為非復(fù)制型顆粒黏膜免疫的良好模型，利用基因重組的手段嵌合表達(dá)不同毒株的抗原決定簇制備的嵌合VLP疫苗以期在疾病暴發(fā)時(shí)能表現(xiàn)出強(qiáng)大的力量。研究VLP 的表面結(jié)構(gòu)和受體結(jié)合域，有助于鑒定外源蛋白潛在的插入位點(diǎn)，將有助于提高VLP 組裝和結(jié)合受體的有效性。基于人和鼠諾如病毒的細(xì)胞培養(yǎng)研究，渴望在不久的將來能有商品化的疫苗投入使用。然而，諾如病毒的快速進(jìn)化也為流行病學(xué)的研究和疫苗的研制提出了挑戰(zhàn)，未來對(duì)諾如病毒疫苗的研究還需不斷努力。除了流行病學(xué)特性，對(duì)我國諾如病毒的分子生物學(xué)特征，例如病毒的全基因結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制、病毒重組和進(jìn)化等方面的了解不多，因此，對(duì)以上各方面均有必要進(jìn)行深入研究。

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