生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離及耐藥性分析

王 娟,黃秀梅，曲志娜，趙思俊，蓋文燕，王玉東，王君瑋

金黃色葡萄球菌在自然界中分布非常廣泛，空氣、水及人和動(dòng)物的排泄物中都能分離到，因此食品受其污染的機(jī)會(huì)很多，是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。為了解我國(guó)目前生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的污染狀況以及分離菌株的耐藥情況，本文對(duì)山東、山西、湖南、重慶以及內(nèi)蒙的部分奶牛場(chǎng)和擠奶站采樣進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為指導(dǎo)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)安全合理用藥和保障消費(fèi)者食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2主要試劑和培養(yǎng)基 7.5%NaCl肉湯、Baird-Parker瓊脂、MH肉湯、生化反應(yīng)管，均為北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鄭州科瑪嘉生物有限公司生產(chǎn)；凍干兔血漿廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Master Mix美國(guó)Promega公司生產(chǎn)；藥敏板天津市金章科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖西班牙Biowest生產(chǎn)；Marker 2000 寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)。

1.3主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、可見分光光度計(jì)、基因擴(kuò)增儀(BIO-RAD)、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)等。

1.4樣品采集 2013年春季分別從山東、山西、重慶、內(nèi)蒙、湖南等5省(區(qū)、市)選擇3個(gè)擠奶站或奶牛場(chǎng)采集樣品，采集擠奶時(shí)前3把后的牛奶作為樣品，每個(gè)點(diǎn)采集40份樣品，共采集鮮奶樣品600份。冷藏條件下，48 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.5金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

1.5.1細(xì)菌分離 取1 mL牛奶樣品接種到10 mL7.5%NaCl肉湯中，于37 ℃溫箱震蕩培養(yǎng)20 h后，將增菌后的液體接種于Baird-Parker平板，36 ℃培養(yǎng)48 h，然后挑取可疑菌落接種到科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上，劃線接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂純化培養(yǎng)后，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。

1.5.2形態(tài)鑒定 在Baird-Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為渾濁帶，最外層有一透明圈,在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上為粉色到紅色圓形菌落。

1.5.3生化鑒定 挑取純化好的單個(gè)菌落進(jìn)行觸酶試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)。觸酶試驗(yàn)陽性的菌落再進(jìn)行血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)；血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)中，呈現(xiàn)凝集者判為陽性，則該菌為金黃色葡萄球菌陽性。

1.5.4PCR鑒定 用DNASTAR 軟件自行設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，上游引物nuc上：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′，下游引物nuc下：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為279 bp。煮沸法提取DNA，反應(yīng)體系(25 μL)如下：上下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1 μL，Mix 12.5 μL ，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，擴(kuò)增36個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含EB 0.5% μg/mL)，電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察并用電泳圖像分析系統(tǒng)拍照，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

陽性菌株擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.6耐藥基因檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)9 對(duì)引物，用PCR方法對(duì)分離鑒定金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)。不同耐藥基因擴(kuò)增引物見表1。

表1 耐藥基因擴(kuò)增引物

1.7藥物耐藥性檢測(cè) 按照CLSI 2008推薦的肉湯稀釋法測(cè)定分離菌株對(duì)7類13種抗菌素的MIC值。7類13種抗菌藥分別是：青霉素類(青霉素、氨芐西林、奧格門丁)；林可霉素類(克林霉素)；頭孢類(頭孢西丁、頭孢噻呋)；大環(huán)內(nèi)酯類(替米考星、紅霉素)；萬古霉素類(萬古霉素)；磺胺類(磺胺異惡唑、新諾明)；喹諾酮類(恩諾沙星、氧氟沙星)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 從采集的600份生牛奶中,檢出金黃色葡萄球菌157株,檢出率為26.17%；其中山東省分離率為12.50%，湖南省分離率為31.67%，山西省為33.33%，重慶市為18.33%，內(nèi)蒙為35.0%。

以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213為陽性對(duì)照，從牛奶樣品中分離菌株能擴(kuò)增出大小約為279 bp基因片段(圖1),陽性對(duì)照樣品均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA基因片段。將分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，該基因片段長(zhǎng)度為279 bp。序列結(jié)果與GenBank公布的序列同源性達(dá)99.5%以上，說明擴(kuò)增的基因片段為金黃色葡萄球菌16S-23SrRNA基因的保守區(qū)序列。

圖1 金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2藥敏檢測(cè)結(jié)果 157株分離菌株除對(duì)恩諾沙星和萬古霉素均敏感外，對(duì)其余11種抗菌藥物均有不同程度的耐藥，尤其對(duì)青霉素類中青霉素和氨芐西林的耐藥率高達(dá)100%和98.73%；其次是對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為49.68%和43.95%；對(duì)奧格門丁、頭孢噻呋、頭孢西丁的耐藥率分別為31.21%、28.03%、18.47%；對(duì)磺胺異惡唑和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為22.29%、5.73%；對(duì)氧氟沙星和替米考星的耐藥率分別為4.46%、3.18%。

各省分離菌株對(duì)11種抗菌藥物的耐藥性有所不同，5省區(qū)分離菌株中，山西省分離菌株的耐藥性最嚴(yán)重，如山西分離菌株對(duì)頭孢噻呋、頭孢西丁、奧格門丁、紅霉素磺胺異惡唑的耐藥率明顯高于其他省區(qū)的分離菌30%～70%；其余4省區(qū)分離菌株對(duì)這些藥物的耐藥性差別不很明顯，耐藥率在20%以上的藥物有4～5種。詳見圖2。

圖2 5省區(qū)牛奶中金黃色葡萄球菌耐藥性情況

分離菌株中，除1株耐1種藥物外，其余菌株均為多重耐藥，多重耐藥率為99.36%；無8耐及以上菌株，主要集中在2耐(36.05%)、3耐(19.77%)、5耐(12.79%)和6耐(17.44%)，占分離菌株數(shù)的86.05%。

2.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果表明，157株分離菌中，攜帶耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物的msrA基因菌株最多，占分離菌株數(shù)的97.45%，有38.22%的分離菌株攜帶另一耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物基因ermC；有70.06%的菌株攜帶耐β-內(nèi)酰胺酶類藥物基因,14.01%的分離菌株攜帶耐MRSA重要基因femA；同時(shí)攜帶耐喹諾酮類藥物3種基因的分離菌株占94.99%；大多數(shù)分離菌株同時(shí)攜帶多種耐藥基因。具體見表2。

圖4 耐藥因子PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4分析 從檢測(cè)結(jié)果看，生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的污染較嚴(yán)重，檢出率為26.17%，與張彥春等的報(bào)道[2]一致。分離菌株耐藥性較以往報(bào)道[2]有上升趨勢(shì)，尤其是對(duì)青霉素類藥物的耐藥性非常嚴(yán)重，所有分離菌均耐青霉素，157株分離菌中，除2株菌外，其余菌株均對(duì)氨芐西林耐藥，其次是對(duì)紅霉素和克林霉素，耐藥率在40%以上，這與相關(guān)實(shí)驗(yàn)室[3-6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合；且分離菌株的多重耐藥和交叉耐藥嚴(yán)重,多重耐藥率高達(dá)86.05%，與王登峰等人[5]的報(bào)道一致。另外，檢測(cè)出有29株MRSA，其中有22株攜帶femA基因；通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從耐藥表型看，分離菌株對(duì)該類藥的耐藥性不嚴(yán)重，但是大多數(shù)菌株攜帶耐喹諾酮類藥物基因，應(yīng)引起重視。

表2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

從采集的600份生牛奶中,檢出金黃色葡萄球菌157株,檢出率為26.17% ，結(jié)果說明這些奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和擠奶站的生牛奶存在金黃色葡萄球菌的污染,其主要源于在擠奶過程中污染了牛奶。奶牛場(chǎng)要定期檢查奶牛的乳房,并且奶擠出后,要迅速冷藏,細(xì)菌繁殖,以防毒素生成,奶制品要以消毒牛奶為原料,注意低溫保存。食品中食源性致病菌的污染是引發(fā)食品安全問題的重要原因之一,因此，從源頭上杜絕本菌對(duì)食品的污染,以降低金黃色葡萄球菌食物中毒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

金黃色葡萄球菌對(duì)藥物的適應(yīng)性較強(qiáng)，自20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)MRSA以來，該菌的檢出率呈上升趨勢(shì)，本研究共檢測(cè)到29株MRSA菌株，且所有MRSA菌株不僅對(duì)多種抗生素耐藥，而且還攜帶多種耐藥基因。耐甲氧西林和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌都是超級(jí)耐藥菌[7]。污染耐藥性金黃色葡萄球菌的動(dòng)物性食品是導(dǎo)致人類感染的原因[8]。因此，為防止耐藥性金黃色葡萄球菌引起的危害，有必要對(duì)其進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，保障人類健康。

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