寧夏嚙齒動(dòng)物DNA條形碼分析

張 濤,寧文艷,吳建華,劉京利,喬富貴,李貴昌,魯 亮,劉起勇,李 麗,趙建華

寧夏地處黃河中上游，跨東部季風(fēng)和西北干旱區(qū)域，北部被騰格里沙漠、烏蘭布和沙漠、毛烏素沙漠地環(huán)繞，南部有黃土高原插入，地處我國(guó)三大自然區(qū)域的交會(huì)和過(guò)渡地帶。雖然是我國(guó)大陸面積最小的省份之一，但由于南部六盤(pán)山山脈和西北部賀蘭山山脈的存在，使其境內(nèi)具有豐富多樣的自然環(huán)境。從南往北，寧夏的生態(tài)環(huán)境涵蓋了西北地區(qū)所有的生態(tài)類型，有草原、森林、荒漠、濕地、農(nóng)田等截然不同的自然環(huán)境。在這多樣的生態(tài)環(huán)境中，形成了嚙齒動(dòng)物種類的多樣性。寧夏記錄的嚙齒動(dòng)物有38種，其中兔形目3種，嚙齒目35種[1]，僅倉(cāng)鼠科就達(dá)16種。豐富的嚙齒動(dòng)物種群，也造成寧夏具有多種鼠傳疾病的自然疫源地。寧夏東北部屬于內(nèi)蒙古高原長(zhǎng)爪沙鼠鼠疫疫源地[2]，西南部的海原、西吉?jiǎng)t屬于甘寧黃土高原阿拉善黃鼠鼠疫疫源地[3]，南部的六盤(pán)山南麓則存在姬鼠型的流行性出血熱自然疫源地[4]。同時(shí)寧夏中部和南部還是包蟲(chóng)病的流行區(qū)[5]，鼠類在包蟲(chóng)病原的保存和傳播中起到了非常重要的作用。

因此，嚙齒動(dòng)物的準(zhǔn)確分類和科學(xué)防治是寧夏多種重要傳染病預(yù)防和控制的關(guān)鍵。為了提高寧夏各級(jí)專業(yè)人員嚙齒動(dòng)物分類鑒定水平，我們?cè)趯幭母鞯夭杉瘒X動(dòng)物標(biāo)本，并獲得了這些標(biāo)本的DNA條形碼，一方面可以更準(zhǔn)確的對(duì)這些嚙齒動(dòng)物進(jìn)行分類，也為以后利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)嚙齒動(dòng)物進(jìn)行鑒定提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本采集 2013年分別在寧夏賀蘭山、銀川月牙湖、靈武、海原、西吉、鹽池和涇源等地的不同生境采集嚙齒動(dòng)物標(biāo)本154份。經(jīng)外部形態(tài)鑒定有19種(詳見(jiàn)表1)。

表1 嚙齒動(dòng)物形態(tài)鑒定結(jié)果及采集地區(qū)信息

1.2DNA提取 使用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取肝臟或肌肉總DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴(kuò)增與測(cè)序 擴(kuò)增時(shí)首先選用下列通用引物[6]擴(kuò)增線粒體COI基因片段。當(dāng)通用引物擴(kuò)增反應(yīng)失敗時(shí)，則選用Ivanova等[7]設(shè)計(jì)的雞尾酒引物(引物序列見(jiàn)表2)。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系：10×緩沖液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，引物各0.5 μL，LA Taq酶0.15 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃變性45 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表2 PCR擴(kuò)增COI基因的相關(guān)引物序列

1.4DNA序列分析 首先用DNAstar中的Seqman進(jìn)行序列拼接。然后用Clustal W[7]軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖止ふ{(diào)整。同時(shí)將測(cè)定的序列在NCBI網(wǎng)站上運(yùn)行BLAST[8]程序進(jìn)行序列同源性比較，以確保所獲得的序列是目標(biāo)序列。同時(shí)將BLAST結(jié)果中相似度大于95%的，或相似度最大的近緣種的序列也用于系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建，用于判斷形態(tài)鑒定的準(zhǔn)確性。

1.5構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù) 運(yùn)用Mega5[9]軟件分析各基因序列的堿基組成和變異，基于Kimura-2-parameter(K2P)[10]模型的遺傳距離。采用鄰接法構(gòu)建全部COI基因序列的Neighbor Joining樹(shù)。

2 結(jié) 果

154份現(xiàn)場(chǎng)采集的標(biāo)本中，通過(guò)通用引物和雞尾酒引物共擴(kuò)增得到129條序列，成功率為84%。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度符合引物設(shè)計(jì)的預(yù)期，并經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)后確認(rèn)為線粒體COI基因片段。

將這些片段排列整齊后構(gòu)建Neighbor-Joint 樹(shù)，形成20個(gè)具有高支持度的分支(不包括達(dá)烏爾黃鼠)，提示這些個(gè)體由20個(gè)有效的種類構(gòu)成(圖1)，和形態(tài)學(xué)鑒定的種類數(shù)量基本一致。從鹽池縣采集的1只黑線倉(cāng)鼠和從靈武市采集1只黑線倉(cāng)鼠形成了兩個(gè)分支，其中鹽池縣的黑線倉(cāng)鼠與GenBank中的中國(guó)倉(cāng)鼠(Cricetulusgriseus)的相應(yīng)序列具有99%的相似性，因此被修訂為中國(guó)倉(cāng)鼠，而在GenBank中沒(méi)有與靈武市黑線倉(cāng)鼠的COI序列相似的序列，我們還是以黑線倉(cāng)鼠命名。與賀蘭山鼠兔相似度最高的是褐斑鼠兔(Ochotonapallasi)，相似度為96%。與阿拉善黃鼠相似度最高的是達(dá)烏爾黃鼠，相似度為92%。與長(zhǎng)爪沙鼠相似度最高的是子午沙鼠，相似度只有88%，說(shuō)明GenBank中沒(méi)有長(zhǎng)爪沙鼠的相關(guān)序列。其他種類個(gè)體的BLAST結(jié)果都與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，證明形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果是基本準(zhǔn)確的。

在所有確定為一個(gè)鼠種的分支中，除了花鼠的分支內(nèi)遺傳距離較大外(7.5%)，其他分支內(nèi)遺傳距離最大為三趾跳鼠分支的3.2%。中國(guó)倉(cāng)鼠與黑線倉(cāng)鼠的分支間遺傳距離11.6，賀蘭山鼠兔與褐斑鼠兔間遺傳距離為3.6%(詳見(jiàn)圖1)。

圖1 寧夏不同地區(qū)嚙齒動(dòng)物COI基因序列Neighbor Joining樹(shù)

3 討 論

本次調(diào)查比較系統(tǒng)地采集了寧夏南部六盤(pán)山、賀蘭山、東部草原、半荒漠草原和黃土高原(南華山和月亮山)地區(qū)的常見(jiàn)鼠種，而沙漠地區(qū)稀有鼠種都沒(méi)有捕獲，有待以后進(jìn)一步進(jìn)行調(diào)查。

寧夏存在兩種不同類型鼠疫自然疫源地，寧夏南部黃土高原的阿拉善黃鼠鼠疫自然疫源地和東部荒漠草原的長(zhǎng)爪沙鼠自然疫源地。黃鼠在寧夏廣泛分布，一般將東部荒漠草原捕獲的黃鼠定名為達(dá)烏爾黃鼠，南部黃土高原捕獲的黃鼠定名為阿拉善黃鼠。在寧夏鼠疫疫源地宿主動(dòng)物監(jiān)測(cè)中，常常面臨阿拉善黃鼠與達(dá)烏爾黃鼠的分類鑒定問(wèn)題?；谛螒B(tài)特征的分類方法無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分阿拉善黃鼠和達(dá)烏爾黃鼠，因而，阿拉善黃鼠長(zhǎng)期以來(lái)一直被定為達(dá)烏爾黃鼠的一個(gè)亞種。但通過(guò)染色體核型的研究，逐漸發(fā)現(xiàn)典型的達(dá)烏爾黃鼠和一些阿拉善黃鼠存在染色體數(shù)量的差異，因此現(xiàn)在認(rèn)為達(dá)烏爾黃鼠的二倍體染色體2n=36，而阿拉善黃鼠的二倍體染色體2n=38[11]。本研究首次在阿拉善黃鼠鼠疫疫源地分析了當(dāng)?shù)攸S鼠的DNA條形碼序列，并與GenBank中達(dá)烏爾黃鼠的DNA條形碼進(jìn)行了比對(duì)和系統(tǒng)關(guān)系分析，確定兩者之DNA條形碼的遺傳距離達(dá)到8%，達(dá)到了DNA條形碼公認(rèn)的種間的遺傳距離。因此，從分子遺傳學(xué)的角度證明了阿拉善黃鼠和達(dá)烏爾黃鼠是兩個(gè)獨(dú)立種的關(guān)系。下一步需要進(jìn)一步確認(rèn)這兩種黃鼠的分布界限問(wèn)題。阿拉善黃鼠的分布范圍是否就是原來(lái)達(dá)烏爾黃鼠阿拉善亞種的分布范圍還需要通過(guò)大量標(biāo)本的調(diào)查才能確定。由于寧夏獨(dú)特的地理環(huán)境，使倉(cāng)鼠種群得到了很好的進(jìn)化和發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)16種之多[1]。監(jiān)測(cè)中倉(cāng)鼠間種群的鑒定，存在不少的疑慮，特別是幼鼠。黑線倉(cāng)鼠是我國(guó)華北地區(qū)比較常見(jiàn)的倉(cāng)鼠種類。不少個(gè)體由于背上黑線不是很明顯，當(dāng)捕獲標(biāo)本沾水受潮時(shí)，黑線更不易察覺(jué)，因此，容易被誤定為灰倉(cāng)鼠。這次在寧武臨河監(jiān)測(cè)點(diǎn)捕獲的黑線倉(cāng)鼠標(biāo)本在沾水的情況下就很難確定到底是黑線倉(cāng)鼠還是灰倉(cāng)鼠。通過(guò)DNA條形碼的使用，更正了形態(tài)學(xué)鑒定可能的錯(cuò)誤。

我國(guó)的相關(guān)文獻(xiàn)至今只記錄黑線倉(cāng)鼠一種[11-12]，但有人通過(guò)染色體特征分析，認(rèn)為北部有黑色縱紋的倉(cāng)鼠應(yīng)該分為3種，即黑線倉(cāng)鼠Cricetulusbarabensis，中國(guó)倉(cāng)鼠Cricetulusgriseus，和擬黝倉(cāng)鼠Cricetuluspseudogriseus。但由于這個(gè)結(jié)果沒(méi)有被后人證實(shí)，所以這3個(gè)種是否成立還存在疑問(wèn)[11, 13]。雖然在形態(tài)上中國(guó)倉(cāng)鼠被認(rèn)為是黑線倉(cāng)鼠的一個(gè)亞種，但GenBank中中國(guó)倉(cāng)鼠的DNA條形碼與寧夏黑線倉(cāng)鼠的遺傳距離達(dá)到6%，很可能是兩個(gè)獨(dú)立的物種。因此關(guān)于黑線倉(cāng)鼠是否存在形態(tài)學(xué)隱種的問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。當(dāng)然在倉(cāng)鼠鑒定過(guò)程中，如果能參考頭骨的形態(tài)及測(cè)量數(shù)據(jù)，將更具科學(xué)性，但無(wú)疑增加了工作量。

分布于寧夏賀蘭山一帶的鼠兔一直以來(lái)被認(rèn)為是高山鼠兔的一個(gè)亞種。但近來(lái)被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的種：賀蘭山鼠兔[11]。而本次調(diào)查在賀蘭山獲得的鼠兔，其DNA條形碼則與褐斑鼠兔的DNA條形碼遺傳距離比較接近，只有不到4%的差異。因此我們暫時(shí)將該份標(biāo)本定位褐斑鼠兔。至于賀蘭山地區(qū)是否存在兩個(gè)不同的鼠兔種類，還有待進(jìn)一步的調(diào)查。

黑線姬鼠在寧夏是流行性出血熱的重要宿主，主要分布于寧夏南部的六盤(pán)山山區(qū)。因此寧夏南部也是寧夏流行性出血熱的主要流行地區(qū)。隨著我國(guó)山區(qū)退耕還林政策的執(zhí)行，寧夏中部和南部山區(qū)的植被情況在過(guò)去的十年中得到很大改善。因此，黑線姬鼠的分布范圍也逐漸從寧夏南部的局部地區(qū)向北部逐漸擴(kuò)散。本次調(diào)查在六盤(pán)山外圍的西吉縣火石寨旅游景區(qū)及農(nóng)田中捕獲了為數(shù)不少的黑線姬鼠，而且在海原縣南華山也捕獲到許多。因此，有必要對(duì)寧夏六盤(pán)山外圍地區(qū)黑線姬鼠的分布范圍和密度進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè)，對(duì)高密度地區(qū)并做好流行性出血熱的健康宣傳工作，預(yù)防流行性出血熱在當(dāng)?shù)爻霈F(xiàn)暴發(fā)流行。

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