張 琳，侯學(xué)霞，耿 震，郝 琴

萊姆病是一種主要經(jīng)蜱傳播的人獸共患病，可引起人體多系統(tǒng)、多器官的損害。其致病病原體為伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)，俗稱萊姆病螺旋體。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已有全世界五大洲70多個(gè)國(guó)家有萊姆病的存在，且發(fā)病區(qū)域和發(fā)病率均呈擴(kuò)大和上升趨勢(shì)，該病已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為重點(diǎn)防治研究對(duì)象[1]。

我國(guó)自上世紀(jì)八十年代開始研究萊姆病以來，已經(jīng)發(fā)表了百余篇文獻(xiàn)，報(bào)道了針對(duì)萊姆病在29個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)開展了萊姆病血清學(xué)調(diào)查。被調(diào)查人群的血清抗體陽(yáng)性率為0.22%～44.18%，并從20個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)的病人、動(dòng)物和/或蜱中分離出病原體，證實(shí)我國(guó)存在萊姆病的自然疫源地，部分地區(qū)還有典型萊姆病病例存在[2]。

我國(guó)萊姆病疫區(qū)主要分布于東北部、西北部和華北地區(qū)，分布范圍廣，高危人群多。然而針對(duì)我國(guó)各地林區(qū)媒介蜱的萊姆病帶菌率的調(diào)查數(shù)據(jù)十分缺乏，已有的研究地點(diǎn)主要集中在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、北京、廣東等地[3-5]。在青海省循化撒拉族自治縣以及遼寧省的新賓滿族自治縣尚沒有數(shù)據(jù)報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，青海省與遼寧省均存在萊姆病病例[6-7]。并且青海省循化縣的草場(chǎng)面積廣，達(dá)到213萬畝，森林覆蓋率達(dá)20.5%[8]，遼寧省新賓縣的森林面積達(dá)140萬畝，覆蓋率61%，擁有14個(gè)國(guó)有林場(chǎng)。因此我們選擇在林區(qū)覆蓋率較高的兩個(gè)地點(diǎn)采集蜱樣本，檢測(cè)萊姆病螺旋體帶菌率，是十分有必要的。

目前蜱帶菌率的檢測(cè)方法主要為PCR方法，包括：普通PCR和巢式PCR。常用的靶基因有：5S-23SrRNA基因間隔區(qū)，ospA，fla等。因?yàn)槌彩絇CR比普通PCR具有更高的敏感度和特異度，因此得到廣泛的應(yīng)用。2000年Notomi[9]等開發(fā)了一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特點(diǎn)是在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶基因序列。2011年，楊吉飛等[10]建立了檢測(cè)蜱中萊姆病螺旋體的LAMP方法。在本研究中，我們同時(shí)應(yīng)用兩種方法對(duì)蜱帶菌率進(jìn)行檢測(cè)，以提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，并對(duì)兩種方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料方法

1.1蜱樣品的采集 蜱采集地點(diǎn)位于青海省循化撒拉族自治縣以及遼寧省新賓滿族自治縣。采用布旗法采集游離蜱，同時(shí)從調(diào)查點(diǎn)自然放牧的牛羊體表采集飽血蜱，放入標(biāo)本瓶保存于4 ℃。

1.2主要試劑 DNA提取試劑盒(DNeasy?Blood & Tissue Kit)由德國(guó)QIAGEN 公司提供。引物由天一輝遠(yuǎn)生物公司合成。PCR相關(guān)試劑由天根生物公司提供，LAMP相關(guān)試劑由廣州華峰生物科技有限公司提供。

1.3陽(yáng)性對(duì)照萊姆病螺旋體DNA的提取 將我實(shí)驗(yàn)室保存的PD91菌株于BSK培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度達(dá)到107/mL時(shí)，將全部培養(yǎng)基裝至1.5 mL Eppendorf離心管中，13 200 r/min離心30 min，棄去上清液，然后用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌3遍，棄去上清液，然后加入100 μL ddH2O重懸，恒溫金屬浴上100 ℃水煮10 min，最后3 500 r/min離心5 min，吸取上清液保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.4蜱樣本萊姆病螺旋體檢測(cè)

1.4.1蜱樣品DNA的提取 采用DNeasy?Blood & Tissue Kit(DNA 提取試劑盒)，提取112只蜱標(biāo)本DNA。

1.4.2巢式PCR

1.4.2.1引物的設(shè)計(jì) 引物參照文獻(xiàn)[11]的rrf(5S)-rrl(23S) rRNA基因間隔區(qū)巢式PCR的引物，引物序列見表1。

表1 rrf-rrl間隔區(qū)巢式PCR引物序列

1.4.2.2巢式PCR反應(yīng)體系 50 μL反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 25 μL，上下游引物(100 μmol/L)各1 μL，第1輪模板4 μL，第2輪模板0.5 μL。

1.4.2.3巢式PCR反應(yīng)條件 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s(第2輪退火溫度為55 ℃)，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。

1.4.2.4巢式PCR產(chǎn)物檢測(cè) 巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像拍照。陽(yáng)性片段約為250 bp左右。

1.4.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)萊姆病螺旋體基因片段 參考文獻(xiàn)[13]，以16s rRNA為靶基因設(shè)計(jì)LAMP引物，分別是上游外側(cè)引物(F3，5′-ttccccgtttggggtcta-3′)和下游外側(cè)引物(B3, 5′- gggccatgatgatttgacgt -3′)，上游內(nèi)側(cè)引物(FIP, 5′-cgttgcgggacttaacccaacattttatacaggtgctgcatggttg-3′)和下游內(nèi)側(cè)引物(BIP,5′- accagcatgtaatggtggggactttttcctcaccttcctccgac -3′)。反應(yīng)體系體積共25 μL，包括10×反應(yīng)緩沖液(2.5 μL)、Primer Mixture(1.3 μL，包括100 μmol/L的FIP和同濃度的BIP各0.4 μL，20 μmol/L的F3和同濃度的B3各0.25 μL)、MgSO4(100 mmol/L, 2 μL)、dNTP(10 mmol/L, 3 μL)、Betaine(2.5 mol/L, 8 μL)、Bst DNA聚合酶(1 μL)和Target DNA(7.2 μL)。反應(yīng)條件為63 ℃ 90 min，80 ℃ 5 min滅活酶。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL于2%瓊脂糖凝膠(含5% Goldenview熒光染料)中電泳，100 V電壓下電泳約40 min，在凝膠成像儀中成像并保存。

2 結(jié) 果

2.1蜱帶菌率 采用巢式PCR與LAMP方法檢測(cè)蜱共計(jì)112只。其中青海省循化縣蜱為51只，巢式PCR檢測(cè)9只陽(yáng)性，LAMP檢測(cè)6只陽(yáng)性，兩種方法共檢測(cè)到12份陽(yáng)性(3份標(biāo)本2種方法均為陽(yáng)性)，青海循化蜱標(biāo)本的總陽(yáng)性率為23.53%(12/51)；遼寧省新賓縣蜱61只，巢式PCR檢測(cè)11只陽(yáng)性，LAMP檢測(cè)9只陽(yáng)性，兩種方法共檢測(cè)到18份陽(yáng)性(2份標(biāo)本2種方法均為陽(yáng)性)，遼寧省新賓縣蜱標(biāo)本的陽(yáng)性率為29.51%(18/51)(見表2)。

表2 112份蜱標(biāo)本的巢式PCR和LAMP檢測(cè)結(jié)果

2.2Nest-PCR和LAMP方法比較 在112只蜱中，巢式PCR共檢測(cè)出20只蜱萊姆病螺旋體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為17.86%(20/112)；LAMP方法共檢測(cè)出15只陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.39%(15/112)。兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.85，P>0.05)(見表1)。在兩種方法對(duì)112份蜱標(biāo)本的檢測(cè)中，5份標(biāo)本巢式PCR和LAMP均為陽(yáng)性，15份巢式PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣本，LAMP檢測(cè)為陰性，10份LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本，巢式PCR檢測(cè)為陰性(見表3)。

表3 巢式PCR與LAMP兩種方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 討 論

萊姆病分布廣泛，全球已有70多個(gè)國(guó)家報(bào)告發(fā)現(xiàn)該病，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，新的疫源地被不斷發(fā)現(xiàn)。我國(guó)29個(gè)省(市、自治區(qū))的人群存在不同程度的萊姆病感染。由于萊姆病的傳播，依靠蜱作為傳播媒介，因此要深入地探討萊姆病的發(fā)生與傳播的機(jī)制，首先了解各地蜱的萊姆病螺旋體的帶菌率。

圖1 部分蜱樣本巢式PCR電泳結(jié)果

我們的采樣點(diǎn)分別位于青海省循化縣和遼寧省撫順新賓縣的崗山。循化縣位于青海省東部，屬青海省海東市管轄，循化縣內(nèi)平均海拔2 300 m，地處黃河谷地，全縣草場(chǎng)面積213萬畝，森林覆蓋率達(dá)20.5%，草場(chǎng)以溫性草原(長(zhǎng)芒草群系、芨芨草群系、冷蒿群系和冰草群系)和高寒草甸(蒿草群系、高山蒿草群系、矮生蒿草群系和線葉蒿草群系)為主[12]。遼寧撫順的新賓縣的森林面積達(dá)140萬畝，覆蓋率61%，擁有14個(gè)國(guó)有林場(chǎng)，草地面積廣。我國(guó)萊姆病疫區(qū)主要分布于東北部、西北部和華北地區(qū)，而疫區(qū)則主要集中在林區(qū)，林區(qū)人群的感染率可達(dá)44.18%，為我國(guó)人群平均感染率的5倍還多。因此我們選擇在林區(qū)覆蓋率較高的兩個(gè)地點(diǎn)采集蜱樣本，檢測(cè)萊姆病螺旋體帶菌率。

圖2 部分蜱樣本LAMP電泳結(jié)果

我們分別采用巢式PCR與LAMP兩種方法檢測(cè)蜱的萊姆病螺旋體帶菌率，共計(jì)112只，采用巢式PCR方法共檢測(cè)出20份樣本萊姆病螺旋體陽(yáng)性，檢測(cè)陽(yáng)性率為17.86%；采用LAMP方法共檢測(cè)15份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.39%。兩種方法檢測(cè)標(biāo)本的陽(yáng)性率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是進(jìn)一步比較兩種方法發(fā)現(xiàn)，在對(duì)112只蜱標(biāo)本的檢測(cè)中，只有5份標(biāo)本巢式PCR和LAMP檢測(cè)均為陽(yáng)性，15份巢式PCR檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本，LAMP檢測(cè)為陰性，10份LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本，巢式PCR檢測(cè)為陰性。兩種方法檢測(cè)的結(jié)果不一致，在楊吉飛等建立的萊姆病螺旋體16S rRNA LAMP方法檢測(cè)蜱樣本的文獻(xiàn)中也有報(bào)道[10]?？赡苁怯捎趦煞N方法的敏感性不同、靶基因不同、以及Bst酶活性等原因造成的[10,12-13]。兩種方法共同使用，可以使結(jié)果更加全面和準(zhǔn)確。

同時(shí)本研究首次報(bào)道了我國(guó)兩個(gè)林區(qū)覆蓋面積較高地區(qū)的蜱萊姆病帶菌率，完善了我國(guó)萊姆病研究中的蜱帶菌率的研究數(shù)據(jù)。為更加系統(tǒng)的研究我國(guó)萊姆病發(fā)生和傳播模式提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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