DNA條形碼技術(shù)鑒定我國(guó)部分白蛉蛉種

周正斌，張 儀，呂 山，施文琦，金長(zhǎng)發(fā)，朱淮民

白蛉屬于雙翅目毛蛉科白蛉亞科(Phlebotominae)，是一類體小多毛的吸血昆蟲，全世界已知800多種，其中約10%蛉種已被證實(shí)可傳播利什曼病等多種疾病[1-2]。特定的蛉種只能傳播特定種類的利什曼原蟲。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)蛉種鑒定存在局限性，其受發(fā)育狀態(tài)的限制。白蛉主要依據(jù)成蟲的內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)、外部形態(tài)，或者雄蟲外生殖器的形態(tài)特征進(jìn)行蛉種鑒定，卵、幼蟲、蛹等非成蟲蟲態(tài)一般難以鑒定。肢體殘缺的成蛉很容易造成種類鑒定不準(zhǔn)確或者無法鑒定。而培養(yǎng)一個(gè)傳統(tǒng)的分類工作者往往需要數(shù)年的專業(yè)培訓(xùn)，不斷縮減的分類學(xué)家隊(duì)伍，使分類學(xué)發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)。DNA條形碼技術(shù)是利用分子標(biāo)記的序列差異將物種鑒定到種水平的一種方法[3]，在物種鑒定方面顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]。目前DNA條形碼技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于昆蟲物種的鑒定[5-7]。然而國(guó)內(nèi)利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行蛉種鑒定的報(bào)道并不多，本文旨在探索基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)是否可以用于我國(guó)常見蛉種的鑒定。另外，通過分析種內(nèi)種間的序列差異，確定白蛉種內(nèi)、種間及屬間關(guān)系，為白蛉DNA條形碼的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 供試白蛉樣本采集地、樣本數(shù)、序列數(shù)和GenBank登錄號(hào)或者序列號(hào)見表 1。

表1 本研究中所用蛉種

1.2白蛉形態(tài)學(xué)鑒定 取白蛉的頭部和尾部，以10% KOH消化后，根據(jù)白蛉的咽甲、受精囊或者雄性尾器特征鑒定其種類[9-10]。余下部分用于提取基因組DNA。

1.3分子試驗(yàn)方法 按照Krueger等[11]方法單只白蛉提取基因組DNA，擴(kuò)增線粒體COI基因按照Hebert等[12]方法。對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。克隆和測(cè)序:利用AXYGEN回收試劑盒(Axygen Scientific，Inc.，USA)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，由上海生工公司進(jìn)行序列雙向測(cè)定，以它們的一致序列為準(zhǔn)。并用DNSP軟件包篩選單倍型。

1.4假基因甄別 本文所使用的43條COI基因序列(長(zhǎng)度663 bp)閱讀框完整，沒有出現(xiàn)堿基的缺失和插入現(xiàn)象，所有序列均能翻譯成氨基酸序列，說明未被核基因中的假線粒體基因序列干擾。

1.5系統(tǒng)發(fā)生分析 獲得的DNA序列先提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，然后用BLAST工具進(jìn)行序列分析、DNA序列檢索；用Genedoc軟件進(jìn)行序列同源性比較；用BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯;用ClustalX[13]軟件進(jìn)行序列比對(duì)；比對(duì)結(jié)果輸入MEGA 4[14]軟件，采用距離法計(jì)算序列間的遺傳距離，并基于Kimura 2-parameter模型，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1 000次檢驗(yàn)獲得系統(tǒng)樹分支的置信度。用DAMBE 5.1.2[15]軟件分析核苷酸取代的飽和度。

2 結(jié) 果

2.1基于COI的序列差異及飽和度分析 本試驗(yàn)研究了來自白蛉亞科3個(gè)屬9物種線粒體COI部分片段。這是一段基因片段長(zhǎng)663 bp的片段，無堿基的插入和缺失，變異位點(diǎn)218個(gè)，占32.9%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)204個(gè)，占30.8%。序列的堿基組成：A：28.8%，G：16.1%，C：17.3%，T：37.9%，AT平均含量66.7%。經(jīng)過MEGA4的計(jì)算，9個(gè)物種的兩兩核苷酸差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表2)顯示各蛉種種內(nèi)線粒體COI核苷酸遺傳距離均小于2%，種內(nèi)核苷酸遺傳距離0.2%～1.6%，種間核苷酸遺傳距離5.9%～17.2%，種間遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離。屬間核苷酸遺傳距離12.0%～14.8%，見表3。

表2 白蛉COI序列的種間遺傳距離

表3 白蛉COI 序列的屬內(nèi)屬間遺傳距離

將線粒體COI基因序列成對(duì)比較，推斷的堿基替代數(shù)同GTR距離進(jìn)行比較來驗(yàn)證白蛉COI基因中是否存在突變飽和現(xiàn)象。線粒體COI基因序列位點(diǎn)轉(zhuǎn)換(S)和顛換(V)序列差異散點(diǎn)圖(圖1)顯示，顛換未發(fā)生突變飽和，但轉(zhuǎn)換表現(xiàn)出明顯的飽和現(xiàn)象。

2.2基于COI構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 本研究一共獲得我國(guó)白蛉亞科9個(gè)物種的43條線粒體COI序列。以筠連秦蛉的COI序列為外群，通過1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)獲得系統(tǒng)樹分支的置信度，9蛉種都以較高的置信度各成一個(gè)進(jìn)化支，但亞屬內(nèi)物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系并沒有被很好地確定，如圖2所示。

圖1 白蛉亞科9蛉種的轉(zhuǎn)換(S)、顛換(V)數(shù)目和基于GTR模型的COI基因序列遺傳距離成對(duì)比較所得的遺傳距離散點(diǎn)圖

3 討 論

本文探討了COI基因用于我國(guó)常見蛉種鑒定的DNA 條形碼技術(shù)及系統(tǒng)發(fā)育問題。

加拿大動(dòng)物學(xué)家Hebert[3]等對(duì)動(dòng)物界，包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物共11門13 320個(gè)物種的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基基因序列比較分析，除腔腸動(dòng)物Cnidaria外，98%的物種遺傳距離差異在種內(nèi)0%～2% ，種間平均可達(dá)到11.3%。本研究表明，種內(nèi)的個(gè)體間差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 Hebert 等提出的2%的標(biāo)準(zhǔn)，種間遺傳距離平均為11.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離，線粒體COI的序列數(shù)據(jù)和NJ樹支持了形態(tài)學(xué)上鑒定的種的地位，如圖2(A)。由于COI序列核苷酸取代飽和，這可能影響了高階元屬的分類結(jié)果，當(dāng)只取COI序列編碼蛋白密碼子的第一、二位核苷酸構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí)，不同屬的物種可以清楚地區(qū)分開來，如圖2(B)。DNA條形碼與DNA分類是不同的。雖然DNA條形碼也用系統(tǒng)發(fā)育分析樹來做分析，但僅僅是為了驗(yàn)證物種的單源性和聚類關(guān)系，通常要求所用分析方法簡(jiǎn)潔、快速，所以這些樹并不能看做系統(tǒng)發(fā)育樹。而DNA分類在為物種鑒定提供平臺(tái)的同時(shí)，還需要探討物種的系統(tǒng)發(fā)育、高階元分類地位等深層次的問題，并且要用到多種軟件、多種算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，運(yùn)算較復(fù)雜。本研究顯示在亞屬水平上基于線粒體COI序列的NJ樹與形態(tài)學(xué)分類有差異，如在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)中冷氏白蛉、吳氏白蛉同屬白蛉屬勞蛉亞屬，親緣關(guān)系較近[16]，但是以p-distance計(jì)算冷氏白蛉與吳氏白蛉種間遺傳距離(0.151)大于冷氏白蛉與阿蛉亞屬中華白蛉間的遺傳距離(0.059)，以NJ法構(gòu)建的分子進(jìn)化樹也顯示了相同的結(jié)果。本研究DNA條形碼為DNA分類提供了部分?jǐn)?shù)據(jù)，可以作為DNA分類系統(tǒng)的初步實(shí)踐，但對(duì)于我國(guó)白蛉DNA分類有待于進(jìn)一步深入研究。

圖2 基于43條白蛉COI序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

在分子進(jìn)化過程中，由mtDNA片段轉(zhuǎn)移到核序列中而形成的細(xì)胞核線粒體假基因(Numts)廣泛存在于無脊椎動(dòng)物細(xì)胞中。Numts序列和目的mtDNA序列協(xié)同擴(kuò)增將嚴(yán)重影響DNA條形碼研究。但通過采用多種方法可以避免和解決Numts的擴(kuò)增問題，如利用是否存在電泳雜帶、測(cè)序雙峰、背景噪音等現(xiàn)象而無法獲取目的序列等現(xiàn)象可以初步判斷PCR產(chǎn)物中是否存在Numts。Numts一般含有閱讀框內(nèi)終止密碼子、插入缺失或點(diǎn)突變位點(diǎn)等，對(duì)獲得條形碼序列對(duì)序列進(jìn)行分析，通過檢測(cè)成分偏向性，是否能正確翻譯以及與相近種序列比對(duì)可以確定序列是否為目的COI序列[17]。此外采用RT-PCR技術(shù)或設(shè)計(jì)特異引物對(duì)物種進(jìn)行特異擴(kuò)增將有效避免這一問題[18-19]。

線粒體基因?qū)儆谀赶颠z傳，可能會(huì)由于種間線粒體基因交流出現(xiàn)一些導(dǎo)致錯(cuò)誤鑒定的現(xiàn)象。比如:種間雜交和內(nèi)共生菌(如:沃爾巴克wolbachia)感染，所導(dǎo)致的對(duì)線粒體基因的間接選擇[20]。目前國(guó)內(nèi)尚未見白蛉wolbachia感染的報(bào)道，但以色列、埃及境內(nèi)的Phlebotomuspapatasi中已發(fā)現(xiàn)沃爾巴克菌感染[21]。沃爾巴克等內(nèi)共生菌的存在，會(huì)造成寄主 mtDNA 多態(tài)性降低或提高，從而影響基于mtDNA的 DNA 條形碼及系統(tǒng)發(fā)育研究。因此在解決一些特殊類群，或處理一些特殊情況如假基因、基因交流等時(shí)，需要再加一條候補(bǔ)基因如核基因等[22]。選取多個(gè)基因共同用于物種鑒定不僅能豐富分子分析數(shù)據(jù)，而且能使鑒定與分析更為準(zhǔn)確。

DNA 條形碼不能取代形態(tài)學(xué)分類，而是二者相輔相成，DNA 條形碼數(shù)據(jù)能引導(dǎo)形態(tài)數(shù)據(jù)分析更為仔細(xì)。顯著的 DNA 條形碼差異與形態(tài)學(xué)特征以及生態(tài)學(xué)等研究相結(jié)合才能在物種鑒定中取得最有效的結(jié)論。綜上所述，基于線粒體 COI 基因的 DNA 條形碼在白蛉蛉種的種、屬水平上可以很好的區(qū)分，可以作為一種有效的工具在白蛉物種鑒定中進(jìn)行應(yīng)用。

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