TLR7在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用研究

李瑞芳,管志玉,付玉榮,伊正君

很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TLR7會(huì)增強(qiáng)宿主抗感染免疫應(yīng)答能力。在感染早期，TLR7可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌來增強(qiáng)機(jī)體快速地對病原體感染做出全身性免疫應(yīng)答[1]，以有助于清除細(xì)菌、病毒的感染[2-3]。ssRNA作為TLR7的配體，可以有效的激活TLR7，刺激免疫細(xì)胞表達(dá)TLR7增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Monica A Delgado指出，卡介苗(BCG)感染巨噬細(xì)胞后，用TLR7配體咪喹莫特或ssRNA治療細(xì)胞或使細(xì)胞饑餓后，顯示TLR7能通過誘導(dǎo)自噬減少胞內(nèi)BCG。但是，在結(jié)核分枝桿菌感染中TLR7的作用至今未有報(bào)道。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞為模型，結(jié)核分枝桿菌感染后加入化學(xué)合成的TLR7激活基序ssRNA激活TLR7，研究TLR7在結(jié)核分枝桿菌感染中的影響，以期能為結(jié)核分枝桿菌的防治提供幫助。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(GBICO公司)；胎牛血清(GBICO公司)；羅氏培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)室自配)；ssRNA(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)；異煙肼；胰酶；磷酸鹽緩沖液PBS(實(shí)驗(yàn)室自配)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒、小鼠IL-4 ELISA試劑盒、小鼠IL-12 ELISA試劑盒(北京達(dá)科為生物科技有限公司)；結(jié)核桿菌(TB)核酸測定試劑盒(上海之江生物科技有限公司)，所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Fax-2100型酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡(Olympus公司)，Thermo型CO2培養(yǎng)箱，HHB114-20型恒溫培養(yǎng)箱，Sirion200型掃描電鏡(FEI公司)。

1.2方法

1.2.1TLR7對結(jié)核分枝桿菌吞噬率的影響 細(xì)胞用完全1640培養(yǎng)基稀釋至3×105/mL，2 mL /孔加入24孔板，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)至細(xì)胞牢固貼壁，次日，用新鮮的完全1640培養(yǎng)基換液，1 mL /孔。實(shí)驗(yàn)細(xì)菌接種于羅氏平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)約15 d，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行研磨，0.9%生理鹽水反復(fù)淘洗后自然沉淀3次，取上清，調(diào)整細(xì)菌濃度至1.5×108/ mL，沉淀及所有用具高壓滅菌后丟棄。取20 μL/孔加入細(xì)胞上清中。細(xì)胞分組處理，每組重復(fù)3孔。處理如下：感染后未激活組、感染后加入ssRNA組(20 μL/孔，終濃度10 μg/mL)、饑餓組(即感染前用無血清1640培養(yǎng)基換液)、感染后加入異煙肼組(20 μL/孔，終濃度10 μg/mL)。處理后于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收集感染后0 h、1 h、3 h、5 h細(xì)胞上清，煮沸后離心取上清液進(jìn)行熒光定量PCR檢測。定量PCR反應(yīng)體系如下：36 μLTB核酸熒光PCR檢測混合液(含有dNTP、1對引物和1條熒光探針的溶液)，0.4 μL酶(Tag+UNG)，4 μL細(xì)胞上清。反應(yīng)體系按下列參數(shù)進(jìn)行：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次，單點(diǎn)熒光檢測在60 ℃，熒光通道檢測選擇FAM通道。

1.2.2TLR7對結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞作用的形態(tài)學(xué)觀察 取5×106個(gè)細(xì)胞，200 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)過夜培養(yǎng)，感染3 h后加入50 μL ssRNA(終濃度10 μg/mL)，同時(shí)設(shè)立感染后未激活對照和未感染正常細(xì)胞對照，細(xì)胞于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，步驟如下：細(xì)胞用0.3%胰酶消化，離心，取細(xì)胞沉淀用1 mL 0.01 mol/L pH7.4 無菌PBS重懸后移入1.5 mL EP管，離心；加入0.5 mL 4 ℃預(yù)冷3%戊二醛預(yù)固定，上清吸棄，加1 mL 預(yù)冷3%戊二醛，4 ℃過夜。然后經(jīng)脫水、浸透、包埋聚合、切片(厚度為70 nm)及染色，最后掃描電鏡觀察。

1.2.3TLR7對殺菌活性的影響 細(xì)胞過夜培養(yǎng)，次日換液，細(xì)菌感染3 h后分組處理(分組同1.2.1 TLR7對結(jié)核分枝桿菌吞噬率的影響)，每組重復(fù)3次，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育36 h，收集細(xì)胞上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆茫?xì)胞用無菌1% Tritonx-100裂解，500 μL/孔，完全裂解后，吹打混勻，0.01 mol/L pH7.4 無菌PBS 1∶20稀釋，取100 μL菌液涂于羅氏平板。37 ℃恒溫培養(yǎng)19 d后菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4TLR7對結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞作用的細(xì)胞因子影響 細(xì)胞于24孔板過夜培養(yǎng)，6×105/孔，次日換液，細(xì)菌感染3 h后分組處理(分組同1.2.1 TLR7對結(jié)核分枝桿菌吞噬率的影響)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h、48 h，收集細(xì)胞上清。按試劑盒說明操作，分別檢測細(xì)胞上清中IL-12、IL-4與TNF-α的含量。

2 結(jié) 果

2.1TLR7對結(jié)核分枝桿菌吞噬率的影響 RT-PCR法檢測不同時(shí)間感染后4個(gè)組的細(xì)胞上清結(jié)果顯示，4組均在感染后3 h CT值最高(P>0.05)，即細(xì)胞上清中細(xì)菌濃度最低，而感染5 h后CT值均略有下降，因此以下試驗(yàn)均選定感染時(shí)間為3 h。如圖1所示。

2.2TLR7對結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞作用的形態(tài)學(xué)測定 治療3 h后掃描電鏡觀察，正常細(xì)胞加入TLR7激活基序ssRNA后細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)完整，胞核邊緣整齊，線粒體清晰(圖2，D)，與正常細(xì)胞比較(圖2，A)無顯著變化；感染后加入TLR7激活基序ssRNA治療組感染組比較線粒體相對清晰，吞噬小泡明顯增多(圖2，C)，而感染組細(xì)胞出現(xiàn)較多的細(xì)胞碎片，線粒體不清晰(圖2，B)。

圖1 TLR7對結(jié)核分枝桿菌吞噬率的影響

圖2 掃描電鏡觀察不同處理下的細(xì)胞形態(tài)變化

2.3TLR7對殺菌活性的影響 感染細(xì)胞用不同方法處理后，細(xì)胞經(jīng)1%Tritonx-100無菌裂解于羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)后活菌落計(jì)數(shù)顯示，加異煙肼處理后菌落數(shù)量最少(P>0.05)，而ssRNA組菌落數(shù)量與異煙肼組差別不大(P>0.05)，但是與感染組相比明顯減少(P<0.05)。結(jié)果見圖3所示。

圖3 TLR7對殺菌活性的影響

2.4TLR7對結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞的細(xì)胞因子影響 感染3 h后用不同方法處理細(xì)胞檢測細(xì)胞上清中的IL-12、IL-4與TNF-α的含量，結(jié)果顯示，與感染組比較，處理36 h后，ssRNA組IL-12(P<0.05)、IL-4(P<0.05)上升，處理48 h后IL-4(P< 0.05)下降，TNF-α的含量上升(P<0.05)；異煙肼組在處理48 h后顯示IL-4(P< 0.05)下降、IL-12(P<0.05)上升。結(jié)果見圖4所示。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)感染菌[4]，感染宿主后巨噬細(xì)胞在防御方面起重要作用，是結(jié)核分枝桿菌入侵宿主后侵入的首要細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表達(dá)TLRs識(shí)別病原體并且通過誘導(dǎo)自噬等機(jī)制清除胞內(nèi)病原體[5]?？ń槊?BCG)感染巨噬細(xì)胞后，用TLR7配體咪喹莫特或ssRNA治療細(xì)胞或使細(xì)胞饑餓后，顯示TLR7能通過誘導(dǎo)自噬減少胞內(nèi)BCG。核酸樣結(jié)構(gòu)是盡人皆知的TLR7/8配體，ssRNA可以有效的激活TLR7，ssRNA作為TLR7激動(dòng)劑可以發(fā)展成作為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑[6-7]。本文選用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞作為細(xì)胞模型，加入本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建TLR7激活基序ssRNA檢測TLR7在結(jié)核分枝桿菌感染中的殺菌作用。巨噬細(xì)胞有吞噬能力，但何時(shí)吞噬作用最強(qiáng)還未知，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)感染時(shí)間段1 h、3 h、5 h，定量PCR法檢測細(xì)胞上清中的細(xì)菌數(shù)量，重復(fù)3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)定4組，分別為感染后未激活對照組(以下簡稱感染組)、感染后加ssRNA組(以下簡稱ssRNA組)、饑餓組、感染后加異煙肼組(以下簡稱異煙肼組)。結(jié)果顯示，細(xì)胞吞噬細(xì)菌后每組CT3 h值均高于CT1 h值和CT5 h值(P>0.05)，說明實(shí)驗(yàn)設(shè)定的3個(gè)時(shí)間段，3 h時(shí)吞噬能力最強(qiáng)，因此下步實(shí)驗(yàn)均選定感染時(shí)間為3 h。另外，從CT3 h值-CT1 h值結(jié)果看，差值最大的為ssRNA組，其次為感染組、異煙肼組、饑餓組，由此證明ssRNA組吞噬能力較強(qiáng)，說明TLR7有增強(qiáng)細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力。從CT5 h值看，每組CT值均下降，細(xì)胞狀態(tài)也不如感染后3 h，可能感染細(xì)菌濃度偏高造成細(xì)胞裂解或其他原因使得細(xì)菌片段又釋放入上清中；而ssRNA組CT5 h值高于其他組，細(xì)胞狀態(tài)也好于其他組，這可能與ssRNA激活TLR7有抑制細(xì)胞壞死或凋亡的作用，而后期的掃描電鏡實(shí)驗(yàn)也證明ssRNA組細(xì)胞狀態(tài)明顯好于感染組，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。電鏡觀察自噬小體表明，治療3 h后，ssRNA組細(xì)胞形態(tài)明顯好于感染組，而且吞噬小泡增多，并且有多個(gè)細(xì)胞顯示細(xì)胞處于分裂狀態(tài)，這是否顯示TLR7能促進(jìn)細(xì)胞分裂也未可知，而且未感染加ssRNA對照組細(xì)胞狀態(tài)與正常細(xì)胞無差別，說明TLR7激活基序ssRNA對細(xì)胞沒有不良刺激，結(jié)果表明，TLR7是可以通過自噬機(jī)制殺滅結(jié)核分枝桿菌的。為了進(jìn)一步研究TLR7是否有殺菌的能力，本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞感染后用不同方法處理，最后裂解細(xì)胞計(jì)數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)量。經(jīng)培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)顯示，用不同方法處理細(xì)胞36 h后，細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量最低的為異煙肼組(P>0.05)，其次是ssRNA組、饑餓組、感染對照組，此結(jié)果證明TLR7確實(shí)能增強(qiáng)細(xì)胞殺結(jié)核分枝桿菌的能力。雖然異煙肼組和ssRNA組菌落數(shù)量均明顯低于感染對照組，但是菌落數(shù)量還是偏多，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)加入的藥量偏低并且處理時(shí)間偏短的原因。

圖4 TLR7對結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞的細(xì)胞因子影響

TLR7刺激樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，可通過刺激自噬、產(chǎn)生NO、誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化型細(xì)胞因子等清除微生物。本實(shí)驗(yàn)已證明TLR7能清除胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，但TLR7的殺結(jié)核分枝桿菌機(jī)理此前還未知。為揭示TLR7清除結(jié)核分枝桿菌的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)從細(xì)胞的免疫機(jī)理來研究。從檢測細(xì)胞因子看，ssRNA組IL-12(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)、IL-4(P<0.05)的含量在不同時(shí)間點(diǎn)高于感染組，從結(jié)果看，TLR7還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子殺菌。研究結(jié)果提示，TLR7確實(shí)有增強(qiáng)細(xì)胞殺結(jié)核桿菌的能力，可以通過刺激細(xì)胞產(chǎn)生自噬體和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生等機(jī)制清除胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，而激活基序ssRNA是否可以通過抑制細(xì)胞壞死或凋亡以維持細(xì)胞生存還需要繼續(xù)研究。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的TLR7激活基序ssRNA可以用于治療結(jié)核分枝桿菌，具體治療方案還需要繼續(xù)研究，后期研究期望能為結(jié)核分枝桿菌的治療找到新的突破點(diǎn)，也為臨床用藥提供理論依據(jù)。

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