豬流行性腹瀉研究進展

牛俊超，黃復深，胡佩佩

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種急性高度接觸性的豬腸道傳染病，以腹瀉、嘔吐和脫水為特征，危害非常嚴重。近幾年來，國內(nèi)豬流行性腹瀉（PED）呈高發(fā)趨勢，特別是哺乳仔豬病死率高達100%，嚴重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前對PED 防控的研究仍處于探索階段，還沒有有效的方法從根本上防控該病，現(xiàn)就該病的流行、致病機制和防控研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 流行狀況

豬流行性腹瀉自1971年首次在英國暴發(fā)以來，相繼在比利時、德國、匈牙利、瑞士等許多歐洲國家也都發(fā)生過暴發(fā)流行，20世紀80年代，日本、韓國、中國等一些亞洲國家也暴發(fā)了該病。2013年美國首次報道了此病的流行，其分離株基因組序列與其他地區(qū)流行的毒株有高度的同源性［1］。2013 年古巴也報道有此病流行［2］。PED 近幾年在亞洲的流行相當嚴重，病死率高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟損失［3］。

PED 多發(fā)生在冬季，夏季也有發(fā)生。各種年齡和不同品種的豬群都有易感性，但對不同年齡易感豬群的致死率不同，其中以哺乳仔豬的致死率最高［4-5］。2010年底，PED 在河南省呈現(xiàn)暴發(fā)流行，臨床癥狀與以往類似，主要表現(xiàn)為各年齡段的豬只發(fā)生腹瀉，2周齡以內(nèi)仔豬死亡率可高達100%，造成嚴重的經(jīng)濟損失［6］。PED 的潛伏期一般為5d～8d，人工感染潛伏期為8h～24h。

發(fā)病豬和帶毒豬是主要的傳染源，康復豬會持續(xù)帶毒，并不斷地排出帶有PEDV 的糞便，污染環(huán)境和飼料。自然條件下，PEDV 是通過口與鼻途徑進入豬的體內(nèi)。首先侵犯小腸集合淋巴結(jié)區(qū)，接著進入小腸黏膜上皮細胞，并在細胞內(nèi)復制，病毒由感染處向周圍廣泛擴展，直到侵及全部小腸。此外，最新報道［7］發(fā)現(xiàn)PED 還可以通過乳汁進行垂直傳播。Truong Q L等［8］通過PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬場附近的貓PEDV 呈陽性，至于貓在FED 的流行中的意義有待深入研究。該結(jié)果對FED 的防控有參考價值。

2 病原生物學與致病機理

PEDV 與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）同屬尼多病毒目冠狀病毒屬的l群，為球形囊膜病毒（95 nm～190nm）。病毒中和試驗、免疫熒光技術(shù)均證明PEDV 與豬的其他冠狀病毒（如TGEV）無相同的抗原性［9］。至今尚未發(fā)現(xiàn)PEDV 有不同的血清型存在。PEDV 對乙醇和氯仿敏感，不凝集兔、豬、鼠、犬、馬、雛雞、山羊、綿羊、母牛和人等紅細胞。PEDV 基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，與其他冠狀病毒相似，其基因組5′端有一個帽子結(jié)構(gòu)（cap），3′端 有1個Poly（A）尾，基因組全長為28 033nt?；蚪M5′端非翻譯區(qū)（5′UTR）位于基因1 上游，長296nt，5′UTR 內(nèi)含有長為65nt～98nt的前導序列（L）和1個以AUG 為起始密碼子并擁有Kozak序列（GUUCaugC）和編碼12個氨基酸的開放閱讀框（ORF）?；蚪M3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）長度為334nt，末端連有Poly（A）序列。3′UTR 內(nèi)含有由8個堿基（GGAAGAGC）組成的保守序列，起始于poly（A）上游的73nt處。所有冠狀病毒成員都包含這個序列，只是在基因組中位置不同。剩余基因組序列包括6個ORF，從5′～3′端依次為編碼復制酶多聚蛋白1ab（pp 1ab）、纖突蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）的基因［9］。

研究表明，豬的氨基肽酶是PEDV 的一種功能性受體，在PEDV 侵入宿主細胞的過程中起非常重要的作用［10］。從S蛋白突變體的分析發(fā)現(xiàn)S蛋白含有將該蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體運送到細胞膜的信號［11］。研究表明，PEDV 在細胞內(nèi)的復制需要蛋白水解酶的參與，并且該過程可能涉及S蛋白。當病毒與宿主細胞的細胞膜黏附之后，在外源胰蛋白酶的作用下S蛋白酶解斷裂使感染細胞易于發(fā)生病變［12］。N 蛋白除和基因組RNA 形成RNP 復合體外，還參與病毒的復制和轉(zhuǎn)錄［13］。ORF3 具多態(tài)性，體外細胞模型研究發(fā)現(xiàn)該蛋白具鉀離子通道蛋白活性，同時還可調(diào)節(jié)病毒的繁殖［14］。

PEDV 引起的嚴重腹瀉脫水是導致病豬死亡的主要原因。仔豬在感染PEDV 時，PEDV 在仔豬空腸中后段、回腸、盲腸黏膜絨毛柱狀上皮細胞內(nèi)復制、增殖，由于病毒增殖首先造成細胞器的損傷，繼而出現(xiàn)細細胞功能障礙，破壞腸黏膜柱狀上皮細胞，引起腸絨毛裸露、斷裂、融合及腸上皮細胞內(nèi)各種酶類活性降低或失活，導致營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙、呈現(xiàn)滲透性腹瀉，造成豬只脫水、腹瀉、甚至衰竭、死亡［15-16］。

有關(guān)PEDV 感染的免疫病理學報道較少。De Arriba M L等［17］發(fā)現(xiàn)仔豬感染PEDV 后腸黏膜集合淋巴結(jié)（PP）及腸黏膜固有層內(nèi)的巨噬細胞捕捉病毒顆粒，遞呈抗原給T 輔助淋巴細胞和sⅢIg＋B淋巴細胞，使之轉(zhuǎn)變?yōu)镮gM、IgA 和IgG，進而阻止PEDV 感染、定居、復制，修復損傷的腸絨毛上皮而逐漸痊愈，并可形成免疫記憶。天然免疫在PED 發(fā)生中的作用，早先有研究表明PEDV 感染可以抑制宿主Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。至于其抑制機制，Xing Y等［18］研究發(fā)現(xiàn)PEDV 的復制酶基因編碼的PLP2蛋白（papain-like protease 2）可使RIG-Ⅰ和STING去泛素化，干擾RIG-Ⅰ和STING 介導的信號傳導途徑從而抑制IFN-β的合成。PEDV 對宿主腸上皮細胞的影響可能與PEDV 編碼的N 蛋白和E 蛋白有關(guān)。Xu X 等［19］發(fā)現(xiàn)N 蛋白可延長細胞周期的S期從而抑制腸上皮細胞的生長，并且刺激上皮細胞高水平表達IL-8，促進炎癥反應，E蛋白雖然可以上調(diào)IL-8的表達引起炎癥，但對上皮細胞的細胞周期無調(diào)節(jié)作用。

另外，小鼠的研究結(jié)果［20］表明，PEDV 感染早期可以感染神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞，并可擴至大腦廣泛區(qū)域，引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，PEDV引起神經(jīng)系統(tǒng)病變可能與PEDV 的S蛋白有關(guān)，突變的豬流行性腹瀉病毒的刺突（S）蛋白的胞質(zhì)信號具有增強融合活性的功能。

3 PED的防控

3.1 疫苗

有效的疫苗對豬流行性腹瀉病的防控是至關(guān)重要的。迄今為止，尚未研制出特別有效的控制PED發(fā)生的疫苗。生產(chǎn)實踐中，國內(nèi)以滅活疫苗和弱毒疫苗為主，有些養(yǎng)殖場甚至使用無正式批文的商品化弱毒疫苗，但效果并不理想。當前PED 疫苗的研究主要包括組織滅活苗、細胞滅活苗、弱毒苗、重組蛋白疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、乳酸桿菌苗等。研究表明［21］，S蛋白質(zhì)是豬流行性腹瀉病毒的表面糖蛋白，它可以誘導集體產(chǎn)生特異性中和抗體，但能否成為候選的分子疫苗還有待進一步研究。Meng F等［22］報道了豬流行性腹瀉病毒S基因的重組DNA質(zhì)粒免疫小鼠可誘導產(chǎn)生高水平的中和抗體及以IFN-γ表達水平增高、T 淋巴細胞的增殖和CD 4＋和CD 8＋T 細胞亞群的數(shù)量增加等為特征的細胞免疫應答。Sun D B等［23］報道，利用噬菌體展示技術(shù)得到的S蛋白的模擬表位與抗PEDV 的單克隆抗體具有很好的親和性，是否可以作為模擬表位疫苗值得深入探討。

因PEDV 的腸嗜性，通過消化道免疫以激發(fā)腸道黏膜免疫（尤其是sIgA 的產(chǎn)生）可能是預防該病的有效途徑，研究者試圖利用載體疫苗通過口服實現(xiàn)此目標。Liu D Q 等［24］發(fā)現(xiàn)，表達PEDVS蛋白乳桿菌和表達PEDV 年蛋白乳桿菌共口服免疫可誘導小鼠產(chǎn)生高水平的全身和黏膜免疫應答，包括產(chǎn)生IL-4、IFN-γ和針對PEDV 的中和抗體。葛俊偉等［25］發(fā)現(xiàn)，以大腸埃希菌耐熱性內(nèi)毒素B為佐劑與PEDV 的中和抗原共表達于乳酸桿菌中經(jīng)口腔和胃免疫，可誘導小鼠產(chǎn)生黏膜和體液免疫應答。

3.2 藥物防控

目前有報道使用混合單克隆抗體、高免血清、卵黃抗體等生物制品被動免疫效果比較明顯，但此類制劑未商品化。Sun D 等［26］報道，利用噬菌體展示技術(shù)從PEDV N 蛋白抗體庫的篩選出小鼠scFv對豬的N 氨基肽酶（PEDV的細胞受體）有很好的親和性，是一個值得關(guān)注的結(jié)果。

使用阿托品、地芬諾酯、山莨菪堿緩解腸道痙攣，對于治療PED 一定的作用。Yook H S報道［27］槲皮素-7-鼠李糖苷在降低PEDV復制方面非常有效，IC50為0.014μg／mL。槲皮素-7-鼠李糖苷對PEDV 作用的機制既不是通過活性氧的形式，也非通過直接作用于病毒，而是通過干擾PEDV 的復制從而影響感染的起始過程。研究發(fā)現(xiàn)櫻桃提取物也具有抗病毒的特性，其IC50用量很低。體內(nèi)和體外試驗表明［28］，朝鮮淫羊藿的水提物也具有很好的抗PEDV 的活性。

所有這些結(jié)果對于開發(fā)抗PEDV 的飼料添加劑或防控PED 是有益的。

4 展望

PEDV 是一種以腹瀉、嘔吐和脫水為特征急性高度接觸性豬腸道傳染病，危害非常嚴重，近幾年來呈現(xiàn)高發(fā)趨勢，對部分規(guī)?；i場造成慘重損失，特別是哺乳仔豬病死率高達，嚴重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，尚未有很好有效的防控方法。對于PED 的病原生物學、致病機制雖有一些研究，但是對病毒對細胞的侵入、復制等并不十分清楚，例如PEDV 的S 蛋白免疫動物并不能有效的阻斷病毒對細胞的侵入?？磥頇C制是復雜的。從疫苗方面看，死疫苗重組蛋白疫苗也不能阻斷該病的發(fā)生，原因何在，有待于免疫病理學機制的揭示。在現(xiàn)有條件下，篩選具有很好的抗病毒活性的物質(zhì)作為飼料添加劑或藥物使用，是非常必要的。

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