痘病毒入侵融合復(fù)合物的研究進(jìn)展

盧 昌，吳國華，王 曼，顏新敏，趙志荀，吳 娜，朱海霞，李 健，張 強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅省生物檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730046）

痘病毒是一種比較大的、復(fù)雜的、有包膜的DNA病毒，該病毒可以在脊椎動(dòng)物或非脊椎動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成復(fù)制。痘病毒大約有100個(gè)或更多的同源性較高的基因存在于所有脊椎動(dòng)物痘病毒中，50個(gè)同源基因存在于脊椎動(dòng)物痘病毒和昆蟲痘病毒中。這些高度保守基因的產(chǎn)物參與了病毒的入侵、基因表達(dá)、DNA復(fù)制、分子內(nèi)二硫鍵的形成以及病毒粒子組裝。然而，那些保守性不高基因的產(chǎn)物則參與了病毒與宿主的特異性反應(yīng)[1]。目前研究最為透徹的屬于正痘病毒基因組，包括天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒。由于天花病毒、猴痘病毒可能被作為潛在的生物武器使用，人們對(duì)正痘病毒的研究也越來越多。痘苗病毒是痘病毒科最典型的成員，其曾經(jīng)作為天花病毒的疫苗使用。雖然天花病毒的疫苗可以為人們提供不錯(cuò)的保護(hù)，但是接種以后仍然會(huì)引起皮膚膿瘡以及淋巴結(jié)疾病和發(fā)熱，嚴(yán)重的甚至可以威脅生命安全，因此也需要一種安全而有效的天花疫苗。痘苗病毒的研究不僅為有效的天花疫苗研究提供了基礎(chǔ)，還為痘病毒科其他成員的研究提供了模板[2]。

絕大多數(shù)DNA病毒可以利用宿主細(xì)胞的蛋白來完成自身基因組的復(fù)制和蛋白的表達(dá)。然而，痘苗病毒（Vaccinia virus，VACV）完全可以利用病毒自身編碼的蛋白在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)種完成它的生命活動(dòng)。當(dāng)感染性病毒粒子入侵到宿主細(xì)胞質(zhì)以后，病毒利用包膜上的蛋白質(zhì)和酶完成病毒早期mRNA和蛋白質(zhì)的合成，緊接著VACV利用這些蛋白質(zhì)完成病毒DNA的復(fù)制。隨后VACV以復(fù)制的DNA為模板完成中后期mRNA的合成，其合成的蛋白質(zhì)參與痘病毒的生命周期，如VACV的抗病毒作用以及痘苗病毒入侵宿主細(xì)胞。VACV與痘苗病毒屬其他成員一樣有許多不同感染形式，如成熟的病毒粒子（MV）、有包膜的病毒粒子（WV）以及細(xì)胞外的病毒粒子（EV）。VACV的MV包括一個(gè)含有雙鏈DNA的病毒核心，兩個(gè)蛋白側(cè)體以及一層囊膜，囊膜上含有20多種病毒蛋白。一些MV可以被修飾后的高爾基體膜或者包內(nèi)囊泡包裹，從而形成MV，同時(shí)另外一些MV隨著細(xì)胞的裂解釋放到細(xì)胞外。EV外膜上含有6種不同的病毒蛋白。MV的產(chǎn)量比較高，可以介導(dǎo)病毒在不同宿主間的傳播，而EV介導(dǎo)病毒在同一宿主體內(nèi)的傳播[3]。

許多有包膜的病毒只需要編碼一種或兩種蛋白質(zhì)就可以滿足病毒的吸附和入侵，然而痘苗病毒需要11種～12種蛋白質(zhì)完成這個(gè)過程。這些蛋白最初是通過鑒定跨膜蛋白的時(shí)候被發(fā)現(xiàn)，并且它們?cè)谒卸徊《痉N十分的保守，并且構(gòu)建突變株來確定它們的表型。目前9種蛋白（A16、A21、A28、G3、G9、H2、J5、L5和 O3）可以構(gòu)成完整的入侵融合復(fù)合體（entry／fusion complex，EFC），并且將 F9和L1定義為EFC相關(guān)蛋白[4]。EFC隨著痘苗病毒DNA復(fù)制的完成而合成，并且專門用于進(jìn)行病毒入侵。

1 入侵融合復(fù)合體亞基蛋白的結(jié)構(gòu)

VACV的MV囊膜上含有20多種結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白主要參與病毒囊膜與內(nèi)吞小泡膜之間的融合，使得病毒核心能夠進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。VACV的融合是由EFC介導(dǎo)的，而EFC由MV或MV樣例子的囊膜蛋白組成的，其中包括 A16[5]、A21[6]、A28[7]、G3[8]、G9[9]、H2[10]、J5[11]、L5[12]、O3[13]及 F9[14]和L1[15]。其中 A16、A21、A28、G3、G9、H2、J5、L5或O3其中任何一種蛋白不能表達(dá)時(shí)，則不會(huì)形成穩(wěn)定的EFC，它們組成EFC的核心。而L1和F9并不是EFC組裝所必須的，L1和F9結(jié)合在EFC周圍，被稱為EFC相關(guān)蛋白。經(jīng)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，VACV的這11種蛋白同系物之間有著一些保守的特征，比如保守的擴(kuò)膜結(jié)構(gòu)域，保守的Cys殘疾以及分子內(nèi)二硫鍵。對(duì)這11種蛋白的同源物進(jìn)行BLAST搜索，我們可以找到包括羊痘病毒屬在內(nèi)的多種痘病毒與之同源的蛋白，并且在其他病毒中沒有找到與之同源的蛋白。編碼EFC蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本都是在病毒感染晚期檢測(cè)到的，且試驗(yàn)證明EFC蛋白是VACV晚期基因編碼的重要結(jié)構(gòu)蛋白。對(duì)這些基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，其ORF上有啟動(dòng)子附近存在著保守的TAAATGG序列，該序列是VACV晚期啟動(dòng)子所特有的[16]。

EFC結(jié)構(gòu)蛋白的大小約在4ku～43ku之間，與其他病毒的Ⅰ型和Ⅱ入侵融合蛋白不同，VACV的EFC蛋白都是非糖基化的蛋白。EFC蛋白最初是通過鑒定跨膜蛋白的時(shí)候發(fā)現(xiàn)的，其中A21、G3、H2和O3擁有N端跨膜結(jié)構(gòu)域，而A16、F9、G9、J5、L1和L5擁有C端跨膜結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白通過其跨膜結(jié)構(gòu)域與MV相連接，非跨膜結(jié)構(gòu)域暴露于MV的囊膜外，發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。疏水結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，G3L有2個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域，分別位于N端和C端。而G3L通過其N端疏水結(jié)構(gòu)域結(jié)合到MV囊膜上，其C端結(jié)構(gòu)域可能結(jié)合到EV的囊膜表面。同時(shí)，G3L中間區(qū)域的保守型遠(yuǎn)低于其N端和C端的疏水結(jié)構(gòu)域，具體原因還不清楚[8]。值得注意的是含有35個(gè)氨基酸殘基的O3是VACV編碼的最小的蛋白。O3其他痘病毒的同源蛋白大小在29個(gè)～48個(gè)氨基酸殘基之間，并且它們之間氨基酸的一致性比較低，但是可以彌補(bǔ)O3的刪除突變。痘病毒科O3L的TM結(jié)構(gòu)域十分的重要，其N端螺旋結(jié)構(gòu)長度一樣，且后面都含有一個(gè)基礎(chǔ)的氨基酸和Pro殘基，再者其C端沒有保守的結(jié)構(gòu)，長度變化很大，這說明EFC結(jié)構(gòu)成員之間的相互作用可能是由TM決定的[13]。

VACV基因組可以編碼3種氧化還原酶（E10、A2.5和G4），這3種酶可以催化IMV的膜蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵。除了O3L和G3L以外，VACV的其他入侵融合蛋白都是通過VACV特有的氧化還原途徑形成保守的分子內(nèi)二硫鍵。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)VACV其他蛋白通過該途徑形成分子內(nèi)二硫鍵。Senkevich T G等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EFC蛋白的分子內(nèi)二硫鍵并不參與EFC的形成，可能在穩(wěn)定EFC結(jié)構(gòu)和EFC發(fā)揮生理功能時(shí)起著一定的作用。其他病毒的EFC分子內(nèi)二硫鍵在病毒與宿主細(xì)胞膜融合過程中有著重要作用，因而我們假設(shè)VACV的EFC分子內(nèi)二硫鍵也可能起著同樣的作用。

EFC相關(guān)蛋白L1是目前為止研究的比較清楚的蛋白質(zhì)。L1蛋白是VACV一個(gè)強(qiáng)有力的中和性抗體，且其暴露于MV的表面。研究發(fā)現(xiàn)，L1R至少存在2個(gè)抗原位點(diǎn)，其中一個(gè)中和表位位于118～128，且抗L1R的中和抗體可以促進(jìn)VIG的效應(yīng)。L1蛋白的N－端結(jié)構(gòu)十分的保守，存在烷基化保守的結(jié)構(gòu) G－X－X－X－S／T。該蛋白可以在其 N 端的倒數(shù)第2個(gè)甘氨酸殘基上發(fā)生烷基化，并且烷基化需要其N端12個(gè)氨基酸殘基的參與。N端甘氨酸的突變可以抑制感染性VACV的互補(bǔ)作用，共聚焦顯微鏡數(shù)據(jù)顯示該突變可以改變L1在細(xì)胞內(nèi)的定位，并且可以減少分子內(nèi)二硫鍵的形成。但是N端甘氨酸的突變并沒有影響其與EFC和MV的結(jié)合。L1的晶體結(jié)構(gòu)是α－螺旋束包裹兩條的β－折疊。L1蛋白的胞外結(jié)構(gòu)含有一個(gè)內(nèi)部疏水凹陷，該凹陷可以容納一個(gè)十四烷酸分子，且該凹陷接近于L1蛋白的N端。L1蛋白的烷基化位點(diǎn)是通過蛋白酶水解暴露出來的，且L1蛋白的二硫鍵可以穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)。此外，可溶性L1可以在病毒吸附階段抑制VACV的入侵，并且L1可以結(jié)合到細(xì)胞表面，與細(xì)胞表面的黏多糖發(fā)生相互作用，這些證據(jù)都表明L1蛋白可能是病毒受體蛋白[18]。

2 入侵融合復(fù)合體亞基蛋白的作用

VACV的EFC蛋白最早是從感染細(xì)胞膜上分離得到的，隨后通過免疫共沉淀等技術(shù)對(duì)VACV其他的EFC蛋白進(jìn)行了初步的分離和鑒定。通過對(duì)EFC缺失毒株的研究發(fā)現(xiàn)，EFC蛋白在VACV新陳代謝過程中有著比較相似的作用。在噬斑試驗(yàn)中，EFC亞基缺失毒株形成的噬斑明顯小于野生型毒株形成的噬斑，同時(shí)EFC亞基缺失毒株的病毒滴度明顯低于野生型。這些數(shù)據(jù)都表明EFC亞基是VACV完成復(fù)制所必須的，與病毒的獨(dú)立密切相關(guān)。在電子顯微鏡下對(duì)EFC亞基缺失的VACV病毒粒子和野生型VACV病毒粒子的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)2個(gè)病毒粒子的形態(tài)幾乎完全相同，無法在電子顯微鏡下進(jìn)行區(qū)別。這表明，EFC亞基并不參與病毒粒子的組裝，EFC亞基的缺失不會(huì)影響病毒粒子的形態(tài)。

有研究表明，VACV的MV是通過胞吞的方式內(nèi)化進(jìn)入宿主細(xì)胞的。病毒以胞吞方式侵入宿主細(xì)胞主要包括兩個(gè)步驟結(jié)合和內(nèi)化。VACV入侵宿主細(xì)胞的最后一步是病毒囊膜與內(nèi)吞小泡膜發(fā)生融合，結(jié)果使病毒核心進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。用MV膜上L1蛋白抗體檢測(cè)病毒粒子與細(xì)胞膜的結(jié)合，用A4核心蛋白抗體檢測(cè)細(xì)胞之內(nèi)病毒粒子的核心[19]，結(jié)果顯示EFC亞基缺失不會(huì)影響MV結(jié)合到細(xì)胞膜上，但是會(huì)影響病毒粒子的脫殼，阻礙病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。野生型VACV感染的細(xì)胞如果暴露于低pH環(huán)境就可以形成合胞體，這種過程被稱為從內(nèi)部融合，這個(gè)過程主要依賴于感染細(xì)胞表面的MV。研究發(fā)現(xiàn)，EFC也參與VACV內(nèi)部融合的合胞體的形成過程，EFC亞基的缺失將阻礙VACV感染細(xì)胞合胞體的形成[20]。

MV囊膜上的A25／A26蛋白異二聚體可以抑制EFC的功能，因此可以防止EFC介導(dǎo)的融合提前發(fā)生，當(dāng)缺少其中任何一種蛋白時(shí)膜融合就能在中性pH條件下發(fā)生。因此可以簡單的推測(cè)，內(nèi)吞小泡內(nèi)的酸性環(huán)境使A25／A26異二聚體解離，從而解除對(duì)EFC功能的抑制，導(dǎo)致膜融合發(fā)生。但是用酸或蛋白酶對(duì)MV進(jìn)行預(yù)處理可以加速病毒的入侵，這表明酸性環(huán)境導(dǎo)致的A25／A26異二聚體解離是部分可逆的，或者不足以啟動(dòng)融合。一些VACV毒株不需要酸性條件即可發(fā)生融合，這可能因?yàn)樗麄儾槐磉_(dá)A25／A26蛋白異二聚體[21]。

此外，許多病毒編碼的蛋白質(zhì)都可以被十四烷酸所修飾，且這些蛋白一般位于病毒的衣殼或囊膜上。烷基化的蛋白在病毒代謝過程中有著重要的作用，例如小核糖核酸病毒的烷基化蛋白VP4是感染性病毒粒子組裝所必須的，也影響著病毒感染細(xì)胞過程中病毒脫衣殼。同樣在痘苗病毒的EFC中也存在著3種可以烷基化的蛋白質(zhì)，G9R、A16L和L1R，這些蛋白的N端存在著可以發(fā)生烷基化的位點(diǎn)。這些蛋白的烷基化可以調(diào)節(jié)其余病毒囊膜或病毒其他成分之間的反應(yīng)，從而影響病毒粒子的組裝、成熟與釋放。除了L1R蛋白的烷基化研究的比較透徹以外，其他兩類蛋白是如何烷基化的，以及烷基化后對(duì)病毒的影響還不是十分的清楚。

3 入侵融合復(fù)合體亞基之間的相互關(guān)系

當(dāng)EFC蛋白中的任何一種蛋白合成被抑制時(shí)，EFC將變的十分的不穩(wěn)定[10]，這說明EFC是通過亞基之間的相互作用結(jié)合到一起的。然而即使在一些不穩(wěn)定條件下，一些EFC亞基之間的作用依然存在，如G3和L5之間的相互作用[8]。EFC亞基之間的相互作用包括 H2與 A28[10]、A16與 G9[9]、G3與L5[8]等。H2蛋白的性質(zhì)與A28比較相似，Nelason等研究發(fā)現(xiàn)H2與A28之間可以發(fā)生直接的相互作用。A28是VACV重要的中和抗體，其免疫原性可以增強(qiáng)與H2之間的相互作用。Shinoda K等[22]研究發(fā)現(xiàn)，A28與H2共表達(dá)可以增強(qiáng)A28的中和活性，并且VACV的中和表位存在于A28蛋白的C－端區(qū)域。G3L可能也與A28L、H2R、A21L發(fā)生結(jié)合作用，但是在EFC形成過程中G3L是如何與這些蛋白相互作用的還不清楚。A16∶G9也可以與融合調(diào)節(jié)蛋白異質(zhì)二聚體A56∶K2相互作用，也可以與A26蛋白相互作用，這種結(jié)合可以抑制感染細(xì)胞多合胞體的形成。

在EFC亞基中，J5、A16和G9之間的同源性比較高，它們?cè)诙徊《究浦卸际值谋Ｊ兀宜鼈冇锌赡芷鹪从谕粋€(gè)基因，經(jīng)過不同的進(jìn)化而在痘病毒入侵過程中行使不同的功能。值得注意的是，這3種蛋白中Cys殘基的位置十分保守，即A16中分子內(nèi)二硫鍵形成的位置與G9和J5中分子內(nèi)二硫鍵形成的位置完全一樣。

4 小結(jié)

VACV的MV上將近有20多種跨膜蛋白，其中有9種蛋白屬于VACV的EFC蛋白，2種蛋白屬于EFC相關(guān)蛋白。這11種蛋白在結(jié)構(gòu)上幾乎沒有相關(guān)性，且每一種蛋白都是痘苗病毒入侵／融合所必須的，因此它們?cè)诠δ芎徒Y(jié)構(gòu)上并不存在冗余。然而，這些蛋白卻有著一些共同的性質(zhì)：①在所有痘病毒屬中都十分保守，是一個(gè)普遍的入侵機(jī)制；②在病毒感染晚期的病毒粒子組裝時(shí)表達(dá)；③擁有一個(gè)跨膜區(qū)域；④屬于MV囊膜上的非糖基化蛋白；⑤可以通過痘病毒細(xì)胞質(zhì)的氧化途徑形成一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵；⑥不影響病毒粒子的形態(tài)。目前我們還不能很好地解釋為什么痘病毒入侵需要如此多的蛋白質(zhì)參與。

此外，小分子質(zhì)量蛋白I2的條件致死性突變表型與其他EFC蛋白的條件致死性表型一樣，因此該蛋白可能屬于EFC蛋白。由于I2蛋白的分子質(zhì)量較小及其疏水性的緣故，不能使用質(zhì)譜法對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行純化，無法對(duì)該蛋白的性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究[23]。

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