雞腸道大腸埃希菌的分離鑒定及對(duì)噬菌體的敏感性測(cè)定

鄒 玲，劉曉飛，任慧英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌病。目前對(duì)大腸桿菌病主要是利用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療，隨著抗生素的大量使用，致病性大腸埃希菌（大腸桿菌）對(duì)藥物的敏感性逐漸降低，耐藥譜不斷擴(kuò)大，治療效果顯著下降［1］。而多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理過(guò)程中濫用抗生素現(xiàn)象普遍存在［2］，更有甚者，將獸藥用作飼料添加劑來(lái)降低動(dòng)物發(fā)病率與死亡率、提高飼料利用率、促進(jìn)生長(zhǎng)和改善產(chǎn)品品質(zhì)，這都將導(dǎo)致畜產(chǎn)品獸藥殘留［3］。據(jù)相關(guān)資料記載和報(bào)道，禽源大腸埃希菌的血清型眾多，目前國(guó)外報(bào)道的血清型已達(dá)160多種［4－5］，且菌株之間缺乏完全保護(hù)，研制出具有高保護(hù)力的大腸埃希菌疫苗十分困難。鑒于新抗菌藥物研發(fā)的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于耐藥菌產(chǎn)生的速度，尋找代替抗生素治療細(xì)菌性疾病的策略成為解決該問(wèn)題的有效途徑［6－7］，噬菌體具有高度特異性，不會(huì)影響到其他的菌群，不會(huì)破壞體內(nèi)微生態(tài)的平衡、導(dǎo)致其他耐受性致病菌的生長(zhǎng)，也很少引起胃腸道反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)等［8］。因此，噬菌體作為一種生物抗菌劑，比抗生素在細(xì)菌性疾病的治療和預(yù)防方面更有優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越廣泛地受到人們的關(guān)注［9］。

本試驗(yàn)擬分離不同健康雞群腸道正常菌群的大腸埃希菌，測(cè)定對(duì)雞致病性大腸埃希菌具有裂解作用的噬菌體能否裂解雞腸道正常菌群的大腸埃希菌。研究結(jié)果可為臨床上應(yīng)用噬菌體制劑進(jìn)行大腸桿菌病的預(yù)防及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及噬菌體 5株雞源致病性大腸埃希菌分離株（血清型分別為 O15、O24、O78、O93，另有一株未定型）；8株噬菌體Bp2、Bp3、Bp4、Bp5、Bp6、Bp7、Bp8、Bp9，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；LB肉湯液體培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、胰蛋白胨水培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化管，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；葡萄糖蛋白胨水、吲哚試劑、MR試劑、V－P試劑；革蘭染液由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 材料采集 自青島10個(gè)蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集健康蛋雞泄殖腔拭子28份，立即放入無(wú)菌EP管中，每個(gè)飼養(yǎng)群體采集1份。

1.2.2 細(xì)菌的分離 分別將采集的樣品在SS培養(yǎng)基上劃線分離，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取粉紅色單菌落，再培養(yǎng)純化，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將純化后的單菌落接種伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24h后，觀察菌落特征。挑取多次劃線所得單菌落進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡檢查。

1.2.3 生化試驗(yàn) 按常規(guī)方法在無(wú)菌條件下，用接種針將分離純化的疑似大腸埃希菌單菌落分別進(jìn)行五糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）發(fā)酵、三糖鐵試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)。

1.2.4 大腸埃希菌對(duì)噬菌體的敏感性測(cè)定

1.2.4.1 菌懸液的制備 分別挑取28株菌的單菌落分別接種于1號(hào)～28號(hào)盛有5mL LB肉湯的試管中，37℃、160r／min振蕩培養(yǎng)8h，即得到菌懸液。

1.2.4.2 單斑法測(cè)定大腸埃希菌對(duì)噬菌體的敏感性［10］取100μL菌懸液分別均勻涂布于普通瓊脂平板上，用微量移液器分別取2μL噬菌體懸液滴于平板的不同位置上，加樣時(shí)，各種噬菌體懸液間不能有接觸，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。待自然干燥后37℃培養(yǎng)6h～8h，觀察結(jié)果。

1.2.4.3 雙層平板法測(cè)定大腸埃希菌對(duì)噬菌體的敏感性［11］分別將噬菌體和菌懸液的混合液加入至已融化的上層瓊脂培養(yǎng)基中（55℃）立即旋搖，混勻后將上層培養(yǎng)基迅速對(duì)號(hào)倒入已準(zhǔn)備好的底層瓊脂上，輕搖平板，使上層培養(yǎng)基鋪滿平板，待其凝固后，37℃倒置培養(yǎng)6h～8h，觀察結(jié)果。

1.2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將1.2.4中所測(cè)的對(duì)噬菌體敏感的菌株、隨機(jī)選擇一株對(duì)8株噬菌體均不敏感的菌株及一株雞致病性大腸埃希菌分別接種LB肉湯，37℃、160r／min振蕩培養(yǎng)8h后作為致病力試驗(yàn)用菌液，每株菌接種2只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL，共分4組，致病性大腸埃希菌組為陽(yáng)性對(duì)照，未注射組為陰性對(duì)照，接種后隔離飼養(yǎng)。隨時(shí)觀察并記錄死亡情況，及時(shí)剖檢死亡小鼠，觀察病理變化并分離細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性

經(jīng)37℃培養(yǎng)24h～48h后，分離菌在SS瓊脂上形成紅色、圓形隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的小菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色、具有金屬光澤的小菌落。

2.2 革蘭染色

取28個(gè)伊紅美藍(lán)瓊脂平板上黑色帶金屬光澤的單個(gè)菌落涂片，革蘭染色后鏡檢可見(jiàn)到革蘭陰性、兩端鈍圓的短桿菌，無(wú)芽胞。

2.3 生化試驗(yàn)

2.4 對(duì)噬菌體的敏感性測(cè)定

2.4.1 單斑法測(cè)定噬菌體敏感性 由觀察結(jié)果可知，Bp4、Bp7、Bp8、Bp9可裂解9號(hào)大腸埃希菌，Bp5、Bp6疑似可裂解26號(hào)大腸埃希菌，Bp9疑似可裂解28號(hào)大腸埃希菌。BP2、BP3對(duì)所有菌株都不裂解，有待于用雙層平板法進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4.2 雙層平板法測(cè)定噬菌體敏感性 由結(jié)果可知，Bp4、Bp7、Bp8、Bp9 可裂解9號(hào)大腸埃希菌，BP2、BP3、BP5、BP6對(duì)所有大腸埃希菌都不裂解，與單斑法結(jié)果相比，26號(hào)、28號(hào)可疑噬菌斑在雙層平板法中均無(wú)噬菌斑產(chǎn)生。

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將致病性大腸埃希菌及在噬菌體敏感性測(cè)定中對(duì)噬菌體敏感和不敏感的菌株分別接種小鼠。接種小鼠6h以后開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)精神沉郁，被毛粗亂，食欲下降，呼吸急促，不愿走動(dòng)。剖檢死亡小鼠，有肺充血、出血，肝腫大等癥狀。接種10h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，接種陽(yáng)性對(duì)照株的兩只小鼠的死亡時(shí)間分別為10h和16h；接種9號(hào)菌株小鼠的死亡時(shí)間分別為19h和12h；接種14號(hào)菌株小鼠的死亡時(shí)間為36h；接種陰性對(duì)照的小鼠表現(xiàn)正常。3株大腸埃希菌毒力強(qiáng)弱順序?yàn)殛?yáng)性對(duì)照＞9號(hào)＞14號(hào)。

從死亡小鼠肝臟中進(jìn)行大腸埃希菌的分離培養(yǎng)，結(jié)果在SS培養(yǎng)基上得到了紅色菌落，對(duì)分離的單菌落進(jìn)行噬菌體敏感性測(cè)定，與雙層平板法所得結(jié)果一致，說(shuō)明分離到的大腸埃希菌即是所接種的大腸埃希菌。對(duì)4株噬菌體敏感的9號(hào)大腸埃希菌致病力強(qiáng)于對(duì)8株噬菌體均不敏感的14號(hào)大腸埃希菌而稍弱于陽(yáng)性對(duì)照，可能為致病性大腸埃希菌。

3 討論

3.1 關(guān)于正常菌群大腸埃希菌的分離

從本次分離試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，經(jīng)形態(tài)觀察和生化鑒定，最終確定從健康雞泄殖腔拭子中分離到的28株菌均為大腸埃希菌?？梢?jiàn)本試驗(yàn)通過(guò)采集健康雞群肛拭子并從中分離正常菌群中大腸埃希菌的方法是可行的。

3.2 關(guān)于對(duì)噬菌體的敏感性測(cè)定及動(dòng)物致病性試驗(yàn)

單斑法測(cè)定中對(duì)噬菌體疑似敏感的26號(hào)、28號(hào)菌在雙層平板法中并未出現(xiàn)噬菌斑。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明單斑法雖然操作簡(jiǎn)單，但相對(duì)于雙層平板法而言，準(zhǔn)確性較差。原因可能是菌液涂布不均或是噬菌體擴(kuò)散范圍不一，有待于改進(jìn)。

在28株大腸埃希菌對(duì)8株噬菌體的敏感性測(cè)定中，只有9號(hào)菌對(duì)其中4株噬菌體敏感。而由動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)噬菌體敏感的9號(hào)大腸埃希菌致病力僅次于陽(yáng)性對(duì)照，接菌后24h內(nèi)小鼠即死亡，說(shuō)明9號(hào)菌可能為致病性大腸埃希菌，但進(jìn)一步確定仍需做血清型鑒定。由此可見(jiàn)，從健康雞肛拭子中分離出的大腸埃希菌并不一定是正常菌群的大腸埃希菌。

敏感性測(cè)定結(jié)果顯示可裂解致病性大腸埃希菌的噬菌體具有特異性，不會(huì)破壞正常菌群的大腸埃希菌。Chennoufi S C等［12］曾進(jìn)行體外和體內(nèi)的大腸埃希菌噬菌體溶菌活動(dòng)研究，研究結(jié)果顯示，在體外對(duì)噬菌體不敏感的的大腸埃希菌在體內(nèi)也不會(huì)被噬菌體裂解，而且由于噬菌體本身所具有的特性，其可作為抗生素的替代品用于治療細(xì)菌病，將抗生素和噬菌體制劑聯(lián)合使用可能會(huì)更好［13］。

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