回藥燙傷膏中大黃與黃芩提取工藝研究

王瑞紅，王 榮，牛 陽(yáng)，毛跟年，張躍進(jìn)＊，杜 磊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌712100；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川750004；3.陜西科技大學(xué)，陜西西安710021）

淺Ⅱ度燒燙傷累及表皮全層及真皮淺層，其特征是表皮與真皮分離，滲出物積聚于其中而形成皮下水皰［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為由于強(qiáng)熱的作用，熱盛則肉腐，以致皮膚潰爛，火熱迫血妄行而逸出于脈外，則形成瘀血，故治療上以活血祛瘀、清熱解毒、祛腐生肌為主［2－3］?；厮帬C傷膏以回醫(yī)藥具有特色的芳香藥物為主，并用草本之具有“長(zhǎng)性”藥物入于濕性，以滋潤(rùn)紅液質(zhì)，并用芳香藥物中具有活血之藥，促使“木”之長(zhǎng)性顯用，并推動(dòng)“活”之運(yùn)動(dòng)彰顯，運(yùn)之于臟腑，動(dòng)之于四肢百骸，兼行氣血，可促進(jìn)創(chuàng)面肉芽形成，明顯減少創(chuàng)面感染的幾率，加速創(chuàng)面愈合，縮短病程［5］。具有清熱解毒作用的黃柏、大黃和黃芩為燙傷膏中的臣藥，其有效成分的利用程度可直接影響燙傷膏的藥效。本文以燙傷膏處方為基礎(chǔ)，采用乙醇回流法對(duì)大黃與黃芩進(jìn)行合并提取［5－7］，以綜合得分為考察指標(biāo)，研究大黃和黃芩的提取工藝，以便為燙傷膏的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 黃芩飲片、大黃飲片，西安鳴鹿藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 試劑 黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)201305）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)201302），西瑪實(shí)驗(yàn)室提供。

無(wú)水乙醇、鹽酸、丙酮、氫氧化鈉、硅膠G、碘化鉍鉀試劑、三氯化鐵、醋酸鉛、苯、甲酸乙酯、甲酸、鎂粉、正丁醇、冰醋酸等均為分析純?cè)噭籆MC－Na為化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器設(shè)備 島津UV－240分光光度計(jì)，SHZ－D（III）型循環(huán)水式真空泵，RE－52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，HH－2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，DHG－9123A型烘箱，BL610型電子分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的大黃素對(duì)照品1.06mg和黃芩苷對(duì)照品1.03mg，分別置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.021 2mg／mL的大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.020 6mg／mL的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 取大黃素和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL分別置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，大黃素在200nm～600nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描測(cè)試，黃芩苷在200nm～500nm波長(zhǎng)掃描。同法取大黃和黃芩合提物的甲醇溶液在200 nm～60 0nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精確量取大黃素和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1、2、4、6、8mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別于222nm和278nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以大黃素和黃芩苷濃度（μg／mL）C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大黃素和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液各1份，分別以222nm和278nm波長(zhǎng)在室溫下于15、30、45、60、75、90、105、120min時(shí)測(cè)定吸光度。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 精確吸取6份大黃素及黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，以甲醇為空白，分別在222nm和278 nm處測(cè)定吸收度。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，在222 nm和278nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定吸光度6次。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知大黃素含量和黃芩苷含量的提取液樣品12份各1mL，其中6份樣品中各加入大黃素對(duì)照品溶液0.5mL（0.021 2mg／mL），其余6份樣品中分別加入黃芩苷對(duì)照品溶液0.5mL（0.020 6mg／mL），在222nm波長(zhǎng)下測(cè)定大黃素含量，在278nm波長(zhǎng)下測(cè)定黃芩苷含量，計(jì)算加樣回收率。

1.2.8 大黃和黃芩提取方法的確定 根據(jù)回藥燙傷膏配方中各原料藥的性質(zhì)，本文確定大黃和黃芩用乙醇溶液進(jìn)行合并提取，采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)提取效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜合得分＝提取液中大黃素含量×0.3＋提取液中黃芩苷含量×0.3＋干膏率×0.4。

在乙醇濃度、加料量、溶劑用量相同的條件下，首先通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)回流法、超聲法和冷浸法的提取效果進(jìn)行了比較，確定提取方法。

稱(chēng)取大黃和黃芩飲片，分別粉碎成粗粉，過(guò)20目篩，按回藥燙傷膏配方中大黃與黃芩的比例稱(chēng)取大黃和黃芩粗粉各12g，放入圓底燒瓶中，加入乙醇溶液回流提取數(shù)次，合并提取液，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中水浴蒸發(fā)至干，再于干燥箱中105℃干燥至恒重，即得干膏，計(jì)算干膏率。

1.2.9 單因素試驗(yàn) 采用乙醇回流法對(duì)乙醇濃度（550、600、650、700、750mL／L）、提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5h）、乙醇用量（4、6、8、10、12）、提取次數(shù)進(jìn)行了考察，以綜合得分為考察指標(biāo)，結(jié)果表明提取次數(shù)對(duì)考察指標(biāo)影響較小，其余各因素均得到對(duì)考察指標(biāo)影響較大的三個(gè)水平。故后續(xù)試驗(yàn)選擇乙醇濃度、乙醇用量及提取時(shí)間為因素，用正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)選。

1.2.10 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素考察結(jié)果，固定提取次數(shù)為2次，對(duì)乙醇濃度（600、650、700mL）、乙醇用量（6、8、10）和提取時(shí)間（1、1.5、2h）采用乙醇回流法進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以綜合得分為考察指標(biāo)優(yōu)化提取條件。

1.2.11 驗(yàn)證試驗(yàn) 取大黃和黃芩飲片各12g，共3份，粉碎成粗粉，過(guò)20篩，用8倍量的600mL／L乙醇回流提取2次，每次提取1.5h，測(cè)定大黃素含量、黃芩苷含量及干膏率，計(jì)算綜合平分。

2 結(jié)果

2.1 最大吸收波長(zhǎng)

在278nm處黃芩苷有最大吸收、在222nm處大黃素有最大吸收，最終確定大黃素和黃芩苷的測(cè)定波長(zhǎng)分別為222nm和278nm（圖1、圖2和圖3）。

圖1 大黃素對(duì)照品紫外光譜圖Fig.1 UV spectrum of emodin reference sample

圖2 黃芩苷對(duì)照品紫外光譜圖Fig.2 UV spectrum of baicalin reference sample

圖3 樣品提取液紫外光譜圖Fig.3 UV spectrum of the sample extract

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

大黃素回歸方程為：A＝0.098 3C－0.017 2，r＝0.999 1，線性范圍1.93μg／mL～9.67μg／mL；黃芩苷回歸方程為：A＝0.104 2C－0.013 2，r＝0.999 5，線性范圍2.06μg／mL～12.83μg／mL。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

大黃素對(duì)照品的RSD為0.63%，黃芩苷對(duì)照品的RSD為0.78%，表明大黃素和黃芩苷對(duì)照品溶液在120min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

大黃素RSD為0.30%，黃芩苷RSD為0.39%，表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

大黃素的RSD為0.79%，黃芩苷的RSD為0.62%，表明測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

大黃素的平均回收率為103.4%（RSD為1.55%），黃芩苷平均回收率為98.85%（RSD 為0.92%）。

2.7 大黃和黃芩提取方法的確定

回流法提取效率高于超聲法和冷浸法，故確定采用乙醇回流法進(jìn)行提取。

2.8 正交試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析和方差分析見(jiàn)表1和表2。

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，3個(gè)因素對(duì)提取工藝影響大小的順序?yàn)锳（乙醇濃度）＞B（乙醇用量）＞C（提取時(shí)間）；方差分析結(jié)果顯示：因素A（乙醇濃度）對(duì)綜合指標(biāo)的影響有顯著性差異，而因素B（乙醇用量）和因素C（提取時(shí)間）的影響未達(dá)到顯著性差異。由正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)提取條件是A1B2C2，即用8倍量600mL／L乙醇回流提取2次，每次提取1.5 h。選擇A、B、C三因素進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 大黃與黃芩醇提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The orthogonal test results of Rhubarb and Scutellariaalcohol extraction process

表2 大黃與黃芩醇提工藝方差分析結(jié)果Table 2 The variance analysis of Rhubarb and Scutellariaalcohol extraction process

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification of test results

由表3試驗(yàn)結(jié)果可知，在最佳提取工藝A1B2C2下對(duì)大黃和黃芩進(jìn)行乙醇回流提取，三次提取結(jié)果的重復(fù)性較好，均與正交試驗(yàn)結(jié)果相近，表明正交試驗(yàn)所得的提取工藝合理可行。

3 討論

根據(jù)回藥燙傷膏處方中大黃、黃芩及黃柏所含有效成分的理化性質(zhì)，三者合提時(shí)黃柏中的鹽酸小檗堿易與大黃中的蒽醌及黃芩中的黃芩苷形成鹽而沉淀析出，降低有效成分的提取率和藥效［8］。而大黃中的蒽醌和黃芩中的黃芩苷均呈酸性，性質(zhì)相似，因此在本處方有效成分提取時(shí)，大黃與黃芩進(jìn)行合并提取，黃柏采用單提工藝。且經(jīng)過(guò)本試驗(yàn)證明，大黃與黃芩合提取得了較為理想的效果。

大黃和黃芩所含的化學(xué)成分復(fù)雜，在有效成分提取時(shí)，選用的含量指標(biāo)大黃為大黃素、黃芩為黃芩苷，兩味藥在處方中的用量相同，且在處方中均為臣藥［4］，故考慮含量指標(biāo)時(shí)將大黃素與黃芩苷以相同的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行處理。此外，由于本試驗(yàn)的目的是為燙傷膏的制備提供合格原料，因此還需要在提取工藝中考慮干膏率。所以本提取工藝考察時(shí)選擇多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)?？紤]到有效成分含量指標(biāo)的重要性，最終選取提取液中大黃素含量∶提取液中黃芩苷含量∶干膏率的權(quán)重系數(shù)為0.3∶0.3∶0.4。

采用紫外分光光度法測(cè)定大黃素和黃芩苷含量具有方法簡(jiǎn)便、快速、選擇性強(qiáng)、線性范圍寬、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，有利于提高了試驗(yàn)效率，適用于回藥燙傷膏中大黃和黃芩合提時(shí)大黃素與黃芩苷含量的測(cè)定。

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