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    虎源傳染性鼻氣管炎病毒gD 基因重組真核表達載體的構(gòu)建

    2014-06-29 09:01:24張曉明彭仕明
    動物醫(yī)學(xué)進展 2014年9期
    關(guān)鍵詞:氣管炎皰疹病毒傳染性

    張曉明,胡 俊,彭仕明,陳 武*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.廣州動物園,廣東 廣州 510070)

    皰疹病毒Ⅰ型屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒,可引起貓科動物的急性、高度接觸性的上呼吸道感染,發(fā)病率可高達100%[1]。雖然成年貓科動物感染后大多痊愈,病死率很低,但幼仔感染后癥狀嚴重,病死率可達50%,甚至終生帶毒排毒,并可垂直傳播,危害很大[2]。該病毒于1958年由Crande R A和Maurer首次從美國患呼吸道疾病的仔貓體中分離鑒定[3],隨后在歐亞等一些國家也相繼報道檢測到病毒。2012年4月和6月江蘇省蘇州動物園和廣東某養(yǎng)殖場以流鼻涕、咳嗽和支氣管充血和出血為主要癥狀的東北虎和華南虎出現(xiàn)流鼻涕、咳嗽和支氣管充血和出血等臨床癥狀,肖建雄等[4]研究證明了患虎感染的病毒是傳染性鼻氣管炎病毒,該病毒與貓皰疹病毒Ⅰ型基本一致。

    預(yù)防虎源傳染性鼻氣管炎主要以注射疫苗免疫為主,但注射貓傳染性鼻氣管炎疫苗的保護作用甚微,國外動物園也報導(dǎo)類似情況[5]。因此,應(yīng)研制針對虎源傳染性鼻氣管炎的疫苗來預(yù)防虎源傳染性鼻氣管炎,其中研制DNA基因工程疫苗是現(xiàn)時比較快速與良好的方法。貓皰疹病毒Ⅰ型基因組編碼多種蛋白質(zhì),其中g(shù)D糖蛋白具有高度的保守性和抗原性,gD蛋白能與細胞表面分子發(fā)生特異性結(jié)合,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫,是病毒感染特異性宿主的主要作用蛋白[6]。本研究對皰疹病毒Ⅰ型的gD基因進行了擴增、克隆及構(gòu)建真核表達載體,為進一步研究虎皰疹病毒Ⅰ型的基因工程DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞、菌株和載體 293T細胞、pcDNA 3.1(+)表達載體和DH5α大腸埃希菌均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院保存。

    1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶Hin dⅢ和XhoⅠ、DreamTaqTMPCR Master Mix、轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent,F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品;病毒DNA提取試劑盒(viral DNA extraction kit)DNA膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)和質(zhì)粒小提試劑盒(Endo-Free Plasmid Mini KitⅡ),Omega公司產(chǎn)品;RNA抽提試劑(Trizol),Invitrogen公司產(chǎn)品;pMD18-T Simple克隆載體、T4DNA 連接酶、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptⅡI 1st Strand cDNA Synthesis Kit),TaKaRa公司產(chǎn)品;抗his標簽一抗 ,Bioworld公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank已公布的貓傳染性鼻氣管炎病毒基因組序列(序列號FJ478159)設(shè)計了擴增gD基因的一對引物,為方便檢測,在上游引物引入his標簽,同時在上、下游引物分別引入了HindⅢ和XhoⅠ酶切位點(下劃線部分)。引物序列如下:上游:5′-CCCAAGCTTCACCATCATCACCATCATATGAGAC-3′;下游:5′-CCGCTCG AGTTATAGATGGTGAG -3′;引 物 由Invitrogen公司合成。

    1.2.2 病毒DNA的提取及目的基因克隆 病毒液從-80℃超低溫冰箱取出解凍后,使用Viral DNA extraction kit試劑盒進行DNA抽提,然后采用PCR擴增gD基因。PCR擴增體系為:在50μL PCR反應(yīng)體系中加入PCR mix 25μL,上游引物2μL,下游引物2μL,DNA 2μL,ddH2O 19μL。擴增程序為:94℃5min;94℃30s,53℃30s,72℃2min,35個循環(huán);最后72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

    1.2.3 目的片段的膠回收及其克隆載體構(gòu)建PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,使用DNA膠回收試劑盒進行目的基因片段膠回收純化,與PMD18T-simple克隆載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌,將轉(zhuǎn)化好的DH5α大腸埃希菌涂在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)過夜,然后挑取陽性菌落經(jīng)PCR鑒定后,提取重組質(zhì)粒,命名為18T-gD。

    1.2.4 重組真核表達載體的構(gòu)建及其鑒定 抽提重組克隆載體18T-gD,用HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對18T-gD和表達載體pcDNA 3.1(+)進行雙酶切,電泳后進行膠回收純化,用T4DNA連接酶將其定連接目的基因和表達載體,然后進行轉(zhuǎn)化,挑菌和提取質(zhì)粒,得到重組真核表達質(zhì)粒pcDNA-gD。利用Hin dⅢ和XhoⅠ對pcDNA-gD重組質(zhì)粒進行雙酶切和經(jīng)10g/L濃度瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定篩選出陽性重組質(zhì)粒pcDNA-gD并送英濰捷基生物技術(shù)公司測序鑒定。

    1.2.5 重組真核表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞 培養(yǎng)293T細胞,當(dāng)細胞覆蓋率達到70%~90%時,參考轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent說明用TurboFect Transfection Reagent轉(zhuǎn) 染 pcDNA-gD重組質(zhì)粒,并設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染的對照組。將轉(zhuǎn)染細胞置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h。

    1.2.6 重組真核表達質(zhì)粒在293T細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達檢測 使用Trizol法抽提轉(zhuǎn)染48h的293T細胞mRNA,以此為模板進行RT-PCR反應(yīng),檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄。同時收集轉(zhuǎn)染48h的293T細胞,加入100μL的1×SDS上樣緩沖液,充分混合后,100℃水浴5min,然后進行Western blot檢測。先將進行SDS-PAGE,將PAGE膠上蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用含有50g/L脫脂奶粉的TBST溶液4℃條件封閉過夜,TBST沖洗3次后,與鼠抗HIS標簽單克隆抗體在室溫環(huán)境下作用1h,TBST洗滌3次,然后加入HRP標記羊抗鼠IgG二抗,室溫輕搖孵育2h,TBST洗滌3次,最終經(jīng)過DAB顯色。

    2 結(jié)果

    2.1 虎源傳染性鼻氣管炎病毒gD基因PCR擴增結(jié)果

    以提取的虎源傳染性鼻氣管炎病毒DNA為模板,經(jīng)過PCR擴增后,得到的是約1143bp目的基因片段,與預(yù)期大小一致(圖1)。

    2.2 18T-gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

    重組克隆載體18T-gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切電泳鑒定后,得到18T-2692bp的PMD-18Tsimple載體片段和1143bp的目的片段兩條DNA片段(圖2)。

    圖1 FHV-1gD基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplifications of gD gene of FHV-1

    2.3 18T-gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

    重組克隆載體18T-gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切電泳鑒定后,得到18T-2692bp的PMD-18Tsimple載體片段和1143bp的目的片段兩條DNA片段(圖2)。

    圖2 重組克隆載體雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid 18T-gD by enzymatic digestion

    2.4 重組真核表達載體pcDNA-gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

    重組克隆載體pcDNA-gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后,得到5428bp的載體片段和1143bp的目的片段(圖3)。

    2.5 重組真核表達載體在293T細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達檢測

    使用Trizol法分別抽取轉(zhuǎn)染pcDNA-gD和空載體48h的293T細胞的RNA后進行RT-PCR,轉(zhuǎn)染pcDNA-gD的得到1143bp的片段,而轉(zhuǎn)染空載體對照的沒有出現(xiàn)任何DNA片段。表明重組質(zhì)粒在293T細胞中得以成功轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)錄(圖4)。對轉(zhuǎn)染pcDNA-gD和空載體的293T細胞裂解物進行SDSPAGE后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。使用抗His標簽單克隆抗體作為一抗進行Western blot檢測,結(jié)果顯示表達的蛋白可被抗His標簽單克隆抗體識別,條帶大小約42.29ku,與預(yù)期大小一致(圖5)。

    圖3 pcDNA-gD載體的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pcDNA-gD by enzymatic digestion

    圖4 轉(zhuǎn)染293T細胞gD基因RT-PCR結(jié)果Fig.4 RT-PCR amplification of gD gene from 293Tcells after transfection

    圖5 293T細胞表達的gD蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.5 Western blot detection of gD protein expression in 293Tcells

    3 討論

    傳染性鼻氣管炎是貓科動物常見的傳染性病毒性疾病,該病目前并沒有特異性治療方法,主要以注射疫苗預(yù)防為主,針對貓已經(jīng)有商品化的疫苗,但這些針對貓的商品化疫苗據(jù)虎飼養(yǎng)相關(guān)人員反饋,對虎效果不明顯。因此,快速研制出適合虎使用的傳染性鼻氣管炎疫苗是非常有必要的。本研究以虎源傳染性鼻氣管炎病毒為模板,通過PCR擴增其gD基因片段,將其構(gòu)建到pcDNA3.1(+)表達載體上,經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測證實gD基因?qū)崿F(xiàn)正常轉(zhuǎn)錄和表達。

    基因疫苗的研制成功與否,與選取的外源基因的免疫源性強弱有著密切關(guān)系?;⒃窗捳畈《劲裥褪蔷哂心夷さ碾p股DNA病毒,與貓皰疹病毒Ⅰ型在基因上高度相似,病毒囊膜糖蛋白對于病毒侵入宿主細胞并產(chǎn)生病理變化具有極其重要的作用,其作用分別有侵入、吸附和細胞間擴散等[7]。在研制基因疫苗時,通過選取擁有良好免疫原性的糖蛋白能夠讓疫苗激發(fā)機體免疫反應(yīng),保護機體預(yù)防傳染病。貓皰疹病毒1型基因組編碼多種蛋白質(zhì),已報道了17種病毒特異性蛋白和3種具有免疫原性的糖蛋白[8]。貓皰疹病毒Ⅰ型中的gB、gC、gD、gE、gG、gH和gL這7種糖蛋白已得到鑒定,病毒在識別、侵入、感染、在細胞間傳播和感染釋放過程中這些糖蛋白都發(fā)揮著重要作用。gD蛋白具有血凝特性,能產(chǎn)生血凝與血凝抑制作用。Ken M等[9]發(fā)現(xiàn)表達貓皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白的昆蟲細胞可吸附貓的細胞,但不吸附牛、豬和犬的細胞,而且這種吸附可以被相對應(yīng)的單克隆抗體抑制,此外,貓皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白和犬皰疹病毒gD蛋白只能凝集各自宿主的紅細胞,由此推測,這表明gD蛋白在病毒感染的宿主細胞選擇上具有特異性,或者這也正說明為何虎在使用貓的商品化疫苗不能預(yù)防傳染性鼻氣管炎。gD糖蛋白也被認為是病毒粒子表面和病毒感染細胞所必需的主要蛋白,抗此糖蛋白的單克隆抗體在病毒吸附后中和病毒,并顯示出較高的中和效價,表明gD蛋白可能參與病毒進入細胞,并為病毒復(fù)制的必需蛋白。Limcumpao J P等[10]用鼠和牛的免疫試驗顯示,gD能夠引起比gB、gC更強而持久的細胞免疫并用親和層析的方法從貓皰疹病毒Ⅰ型中純化出gD蛋白,用該蛋白免疫小鼠,可使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生病毒中和抗體;Spatz Stephen J等[11]利用重組的FHV-1gD蛋白基因的疫苗病毒免疫家兔,也能產(chǎn)生高滴度的病毒中和抗體。綜上gD蛋白在免疫上的優(yōu)勢,在研制針對虎源傳染性鼻氣管炎的疫苗上,應(yīng)選擇gD蛋白作為主要特異性抗原。

    除抗原外,同時在選擇DNA疫苗的表達載體研制上,必需考慮到其高效性與安全性:① 要制備大量的外源基因,也就是質(zhì)粒載體必須是能在大腸埃希菌中高拷貝的擴增;② 外源基因?qū)爰毎槐唤到猓虎?外源基因在動物細胞內(nèi)能夠高效表達,但不復(fù)制,其表達抗原蛋白的能力越強,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答也越強。同時表達載體必須不含有向宿主細胞基因組內(nèi)整合的序列以保證其使用安全性[12-16]?;谝陨系囊罂紤],本研究選取了真核表達載體pcDNA3.1(+)作為表達載體,它的啟動子是真核細胞中具有較大活性的人巨細胞病毒(CMV)直接早期區(qū),CMV強啟動子對大多數(shù)DNA疫苗具有很強的調(diào)節(jié)功能,當(dāng)表達的抗原基因位于CMV強啟動子后就能夠持續(xù)大量得到表達[17],試驗中pcDNA3.1(+)不僅在DH5α大腸埃希菌中高效拷貝擴增,并且在轉(zhuǎn)染293T細胞后能夠高效大量的表達出目的蛋白,這些都足以證明pcDNA3.1(+)作為DNA疫苗的優(yōu)勢。此外,pcDNA3.1(+)載體還含有Amp基因,Amp基因內(nèi)部的CpG基元(非甲基化脫氧核苷酸片段),能夠增強機體的免疫應(yīng)答[18]。

    試驗中通過構(gòu)建真核表達載體pcDNA-gD成功在真核細胞中表達出虎源皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白,為下一步進行小鼠DNA疫苗免疫試驗研究奠定了基礎(chǔ)。

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