• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    虎源傳染性鼻氣管炎病毒gD 基因重組真核表達載體的構(gòu)建

    2014-06-29 09:01:24張曉明彭仕明
    動物醫(yī)學(xué)進展 2014年9期
    關(guān)鍵詞:氣管炎皰疹病毒傳染性

    張曉明,胡 俊,彭仕明,陳 武*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.廣州動物園,廣東 廣州 510070)

    皰疹病毒Ⅰ型屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒,可引起貓科動物的急性、高度接觸性的上呼吸道感染,發(fā)病率可高達100%[1]。雖然成年貓科動物感染后大多痊愈,病死率很低,但幼仔感染后癥狀嚴重,病死率可達50%,甚至終生帶毒排毒,并可垂直傳播,危害很大[2]。該病毒于1958年由Crande R A和Maurer首次從美國患呼吸道疾病的仔貓體中分離鑒定[3],隨后在歐亞等一些國家也相繼報道檢測到病毒。2012年4月和6月江蘇省蘇州動物園和廣東某養(yǎng)殖場以流鼻涕、咳嗽和支氣管充血和出血為主要癥狀的東北虎和華南虎出現(xiàn)流鼻涕、咳嗽和支氣管充血和出血等臨床癥狀,肖建雄等[4]研究證明了患虎感染的病毒是傳染性鼻氣管炎病毒,該病毒與貓皰疹病毒Ⅰ型基本一致。

    預(yù)防虎源傳染性鼻氣管炎主要以注射疫苗免疫為主,但注射貓傳染性鼻氣管炎疫苗的保護作用甚微,國外動物園也報導(dǎo)類似情況[5]。因此,應(yīng)研制針對虎源傳染性鼻氣管炎的疫苗來預(yù)防虎源傳染性鼻氣管炎,其中研制DNA基因工程疫苗是現(xiàn)時比較快速與良好的方法。貓皰疹病毒Ⅰ型基因組編碼多種蛋白質(zhì),其中g(shù)D糖蛋白具有高度的保守性和抗原性,gD蛋白能與細胞表面分子發(fā)生特異性結(jié)合,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫,是病毒感染特異性宿主的主要作用蛋白[6]。本研究對皰疹病毒Ⅰ型的gD基因進行了擴增、克隆及構(gòu)建真核表達載體,為進一步研究虎皰疹病毒Ⅰ型的基因工程DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞、菌株和載體 293T細胞、pcDNA 3.1(+)表達載體和DH5α大腸埃希菌均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院保存。

    1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶Hin dⅢ和XhoⅠ、DreamTaqTMPCR Master Mix、轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent,F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品;病毒DNA提取試劑盒(viral DNA extraction kit)DNA膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)和質(zhì)粒小提試劑盒(Endo-Free Plasmid Mini KitⅡ),Omega公司產(chǎn)品;RNA抽提試劑(Trizol),Invitrogen公司產(chǎn)品;pMD18-T Simple克隆載體、T4DNA 連接酶、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptⅡI 1st Strand cDNA Synthesis Kit),TaKaRa公司產(chǎn)品;抗his標簽一抗 ,Bioworld公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank已公布的貓傳染性鼻氣管炎病毒基因組序列(序列號FJ478159)設(shè)計了擴增gD基因的一對引物,為方便檢測,在上游引物引入his標簽,同時在上、下游引物分別引入了HindⅢ和XhoⅠ酶切位點(下劃線部分)。引物序列如下:上游:5′-CCCAAGCTTCACCATCATCACCATCATATGAGAC-3′;下游:5′-CCGCTCG AGTTATAGATGGTGAG -3′;引 物 由Invitrogen公司合成。

    1.2.2 病毒DNA的提取及目的基因克隆 病毒液從-80℃超低溫冰箱取出解凍后,使用Viral DNA extraction kit試劑盒進行DNA抽提,然后采用PCR擴增gD基因。PCR擴增體系為:在50μL PCR反應(yīng)體系中加入PCR mix 25μL,上游引物2μL,下游引物2μL,DNA 2μL,ddH2O 19μL。擴增程序為:94℃5min;94℃30s,53℃30s,72℃2min,35個循環(huán);最后72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

    1.2.3 目的片段的膠回收及其克隆載體構(gòu)建PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,使用DNA膠回收試劑盒進行目的基因片段膠回收純化,與PMD18T-simple克隆載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌,將轉(zhuǎn)化好的DH5α大腸埃希菌涂在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)過夜,然后挑取陽性菌落經(jīng)PCR鑒定后,提取重組質(zhì)粒,命名為18T-gD。

    1.2.4 重組真核表達載體的構(gòu)建及其鑒定 抽提重組克隆載體18T-gD,用HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對18T-gD和表達載體pcDNA 3.1(+)進行雙酶切,電泳后進行膠回收純化,用T4DNA連接酶將其定連接目的基因和表達載體,然后進行轉(zhuǎn)化,挑菌和提取質(zhì)粒,得到重組真核表達質(zhì)粒pcDNA-gD。利用Hin dⅢ和XhoⅠ對pcDNA-gD重組質(zhì)粒進行雙酶切和經(jīng)10g/L濃度瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定篩選出陽性重組質(zhì)粒pcDNA-gD并送英濰捷基生物技術(shù)公司測序鑒定。

    1.2.5 重組真核表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞 培養(yǎng)293T細胞,當(dāng)細胞覆蓋率達到70%~90%時,參考轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent說明用TurboFect Transfection Reagent轉(zhuǎn) 染 pcDNA-gD重組質(zhì)粒,并設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染的對照組。將轉(zhuǎn)染細胞置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h。

    1.2.6 重組真核表達質(zhì)粒在293T細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達檢測 使用Trizol法抽提轉(zhuǎn)染48h的293T細胞mRNA,以此為模板進行RT-PCR反應(yīng),檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄。同時收集轉(zhuǎn)染48h的293T細胞,加入100μL的1×SDS上樣緩沖液,充分混合后,100℃水浴5min,然后進行Western blot檢測。先將進行SDS-PAGE,將PAGE膠上蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用含有50g/L脫脂奶粉的TBST溶液4℃條件封閉過夜,TBST沖洗3次后,與鼠抗HIS標簽單克隆抗體在室溫環(huán)境下作用1h,TBST洗滌3次,然后加入HRP標記羊抗鼠IgG二抗,室溫輕搖孵育2h,TBST洗滌3次,最終經(jīng)過DAB顯色。

    2 結(jié)果

    2.1 虎源傳染性鼻氣管炎病毒gD基因PCR擴增結(jié)果

    以提取的虎源傳染性鼻氣管炎病毒DNA為模板,經(jīng)過PCR擴增后,得到的是約1143bp目的基因片段,與預(yù)期大小一致(圖1)。

    2.2 18T-gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

    重組克隆載體18T-gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切電泳鑒定后,得到18T-2692bp的PMD-18Tsimple載體片段和1143bp的目的片段兩條DNA片段(圖2)。

    圖1 FHV-1gD基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplifications of gD gene of FHV-1

    2.3 18T-gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

    重組克隆載體18T-gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切電泳鑒定后,得到18T-2692bp的PMD-18Tsimple載體片段和1143bp的目的片段兩條DNA片段(圖2)。

    圖2 重組克隆載體雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid 18T-gD by enzymatic digestion

    2.4 重組真核表達載體pcDNA-gD的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

    重組克隆載體pcDNA-gD經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后,得到5428bp的載體片段和1143bp的目的片段(圖3)。

    2.5 重組真核表達載體在293T細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達檢測

    使用Trizol法分別抽取轉(zhuǎn)染pcDNA-gD和空載體48h的293T細胞的RNA后進行RT-PCR,轉(zhuǎn)染pcDNA-gD的得到1143bp的片段,而轉(zhuǎn)染空載體對照的沒有出現(xiàn)任何DNA片段。表明重組質(zhì)粒在293T細胞中得以成功轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)錄(圖4)。對轉(zhuǎn)染pcDNA-gD和空載體的293T細胞裂解物進行SDSPAGE后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。使用抗His標簽單克隆抗體作為一抗進行Western blot檢測,結(jié)果顯示表達的蛋白可被抗His標簽單克隆抗體識別,條帶大小約42.29ku,與預(yù)期大小一致(圖5)。

    圖3 pcDNA-gD載體的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pcDNA-gD by enzymatic digestion

    圖4 轉(zhuǎn)染293T細胞gD基因RT-PCR結(jié)果Fig.4 RT-PCR amplification of gD gene from 293Tcells after transfection

    圖5 293T細胞表達的gD蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.5 Western blot detection of gD protein expression in 293Tcells

    3 討論

    傳染性鼻氣管炎是貓科動物常見的傳染性病毒性疾病,該病目前并沒有特異性治療方法,主要以注射疫苗預(yù)防為主,針對貓已經(jīng)有商品化的疫苗,但這些針對貓的商品化疫苗據(jù)虎飼養(yǎng)相關(guān)人員反饋,對虎效果不明顯。因此,快速研制出適合虎使用的傳染性鼻氣管炎疫苗是非常有必要的。本研究以虎源傳染性鼻氣管炎病毒為模板,通過PCR擴增其gD基因片段,將其構(gòu)建到pcDNA3.1(+)表達載體上,經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測證實gD基因?qū)崿F(xiàn)正常轉(zhuǎn)錄和表達。

    基因疫苗的研制成功與否,與選取的外源基因的免疫源性強弱有著密切關(guān)系?;⒃窗捳畈《劲裥褪蔷哂心夷さ碾p股DNA病毒,與貓皰疹病毒Ⅰ型在基因上高度相似,病毒囊膜糖蛋白對于病毒侵入宿主細胞并產(chǎn)生病理變化具有極其重要的作用,其作用分別有侵入、吸附和細胞間擴散等[7]。在研制基因疫苗時,通過選取擁有良好免疫原性的糖蛋白能夠讓疫苗激發(fā)機體免疫反應(yīng),保護機體預(yù)防傳染病。貓皰疹病毒1型基因組編碼多種蛋白質(zhì),已報道了17種病毒特異性蛋白和3種具有免疫原性的糖蛋白[8]。貓皰疹病毒Ⅰ型中的gB、gC、gD、gE、gG、gH和gL這7種糖蛋白已得到鑒定,病毒在識別、侵入、感染、在細胞間傳播和感染釋放過程中這些糖蛋白都發(fā)揮著重要作用。gD蛋白具有血凝特性,能產(chǎn)生血凝與血凝抑制作用。Ken M等[9]發(fā)現(xiàn)表達貓皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白的昆蟲細胞可吸附貓的細胞,但不吸附牛、豬和犬的細胞,而且這種吸附可以被相對應(yīng)的單克隆抗體抑制,此外,貓皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白和犬皰疹病毒gD蛋白只能凝集各自宿主的紅細胞,由此推測,這表明gD蛋白在病毒感染的宿主細胞選擇上具有特異性,或者這也正說明為何虎在使用貓的商品化疫苗不能預(yù)防傳染性鼻氣管炎。gD糖蛋白也被認為是病毒粒子表面和病毒感染細胞所必需的主要蛋白,抗此糖蛋白的單克隆抗體在病毒吸附后中和病毒,并顯示出較高的中和效價,表明gD蛋白可能參與病毒進入細胞,并為病毒復(fù)制的必需蛋白。Limcumpao J P等[10]用鼠和牛的免疫試驗顯示,gD能夠引起比gB、gC更強而持久的細胞免疫并用親和層析的方法從貓皰疹病毒Ⅰ型中純化出gD蛋白,用該蛋白免疫小鼠,可使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生病毒中和抗體;Spatz Stephen J等[11]利用重組的FHV-1gD蛋白基因的疫苗病毒免疫家兔,也能產(chǎn)生高滴度的病毒中和抗體。綜上gD蛋白在免疫上的優(yōu)勢,在研制針對虎源傳染性鼻氣管炎的疫苗上,應(yīng)選擇gD蛋白作為主要特異性抗原。

    除抗原外,同時在選擇DNA疫苗的表達載體研制上,必需考慮到其高效性與安全性:① 要制備大量的外源基因,也就是質(zhì)粒載體必須是能在大腸埃希菌中高拷貝的擴增;② 外源基因?qū)爰毎槐唤到猓虎?外源基因在動物細胞內(nèi)能夠高效表達,但不復(fù)制,其表達抗原蛋白的能力越強,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答也越強。同時表達載體必須不含有向宿主細胞基因組內(nèi)整合的序列以保證其使用安全性[12-16]?;谝陨系囊罂紤],本研究選取了真核表達載體pcDNA3.1(+)作為表達載體,它的啟動子是真核細胞中具有較大活性的人巨細胞病毒(CMV)直接早期區(qū),CMV強啟動子對大多數(shù)DNA疫苗具有很強的調(diào)節(jié)功能,當(dāng)表達的抗原基因位于CMV強啟動子后就能夠持續(xù)大量得到表達[17],試驗中pcDNA3.1(+)不僅在DH5α大腸埃希菌中高效拷貝擴增,并且在轉(zhuǎn)染293T細胞后能夠高效大量的表達出目的蛋白,這些都足以證明pcDNA3.1(+)作為DNA疫苗的優(yōu)勢。此外,pcDNA3.1(+)載體還含有Amp基因,Amp基因內(nèi)部的CpG基元(非甲基化脫氧核苷酸片段),能夠增強機體的免疫應(yīng)答[18]。

    試驗中通過構(gòu)建真核表達載體pcDNA-gD成功在真核細胞中表達出虎源皰疹病毒Ⅰ型gD蛋白,為下一步進行小鼠DNA疫苗免疫試驗研究奠定了基礎(chǔ)。

    [1]Hussein Islam T M,F(xiàn)ield Hugh J.Development of a quantitative real-time TaqMan PCR assay for testing the susceptibility of feline herpesvirus-1to antiviral compounds [J].J Virol Meth,2008,152:85-90.

    [2]Ruch-Gallie Rebecca A,Veir Julia K,Hawley Jennifer R,et al.Results of molecular diagnostic assays targeting feline herpesvirus-1and feline calicivirus in adult cats administered modified live vaccines[J].J Feline Med Surg,2011,13(8):541-545.

    [3]Brice R.Feline herpesvirus infection[J].Bulletin De L Academie Veterinaire De France,2011,164(4):327-330.

    [4]肖建雄,單 芬,黃嘉欣,等.東北虎和華南虎源傳染性鼻氣管炎病毒的PCR檢測和序列分析[J].野生動物,2013,34(3):146-151.

    [5]Witte Carmel L,Nadine L,Rideout Bruce A,et al.Development of a case definition for clinical feline herpesvirus infection in cheetahs(Acinonyx jubatus)housed in zoos[J].J Zoo Wildl Med,2013,44(3):634-644.

    [6]Wilkes Rebecca P,Kania Stephen A.Use of interfering RNAs targeted against feline herpesvirus 1glycoprotein D for inhibition of feline herpesvirus 1infection of feline kidney cells[J].Am J Vet Res,2009,70(8):1018-1025.

    [7]張 碩,李純玲,汪葆玥,等,貓皰疹病毒Ⅰ型的分離與鑒定[J].實驗動物科學(xué),2010,27(2):21-24.

    [8]Gaskell R,Dawson S,Radford A,et al.Feline herpesvirus[J].Vet Res,2007,38(2):337-354.

    [9]Maeda K,Horimoto T,Mikami T.Properties and functions of feline herpesvirus type 1glycoproteins[J].J Vet Med Sci,1998,60(8):881-888.

    [10]Limcumpao J A,Horimoto T,Xuan X N,et al.Homologous and heterologous antibody responses of mice immunized with purified feline herpesvirus type 1and canine herpesvirus glycoproteins.[J].J Vet Med Sci,1991,53(3):503-505.

    [11]Spatz Stephen J,Rota Paul A,Maes Roger K,et al.Identification of the feline herpesvirus type 1(FHV-1)genes encoding glycoproteins G D,I and E:Expression of FHV-1glycoprotein D in vaccinia and raccoon poxviruses[J].J Gene Virol,1994,75(6):1235-1244.

    [12]連艷鮮,鄭寶亮.融合表達豬源C3d與豬流感病毒HA DNA疫苗的構(gòu)建[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2011,32(6):91-95.

    [13]李 斌,蘇乾蓮,趙 武,等.三個豬戊型肝炎病毒ORF2基因連續(xù)片段核酸疫苗的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2013,40(10):1059-1066.

    [14]邱春紅,陳開廷,王永堂,等.核酸疫苗的安全性及其優(yōu)化策略研究[J].生命科學(xué),2013,25(9):858-864.

    [15]陳軼霞,劉俊林,王明明,等.羊痘病毒多表位核酸疫苗的構(gòu)建及表達[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2013,33(8):1196-1200.

    [16]Cui Z.DNA vaccine[J].Adv Gene,2005,54:257-289.

    [17]Wolff J A,Budker V.The mechanism of naked DNA uptake and expression[J].Adv Gene,2005,54:3-20

    [18]和晶亮.DNA疫苗的相關(guān)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2007,28(S):44-47.

    猜你喜歡
    氣管炎皰疹病毒傳染性
    中西醫(yī)結(jié)合治療豬傳染性胃腸炎
    豬傳染性胃腸炎的治療
    荔枝草提取物體外抗單純皰疹病毒Ⅰ型的研究
    中成藥(2018年4期)2018-04-26 07:13:03
    溶瘤單純皰疹病毒治療腫瘤的研究進展
    癌癥進展(2016年8期)2016-08-22 11:22:04
    豬傳染性胃腸炎的防治
    HPLC法同時測定氣管炎顆粒中7種有效成分
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:07:43
    淺談貓傳染性鼻氣管炎的診治
    野雞冠花子液治療單純皰疹病毒性角膜炎70例
    自體血清治療單純皰疹病毒性角膜炎的療效觀察
    雞傳染性喉氣管炎的診治
    精品国产一区二区三区久久久樱花| 又大又黄又爽视频免费| 久久精品久久久久久久性| 亚洲欧美清纯卡通| 精品一区在线观看国产| 五月玫瑰六月丁香| 成人国产麻豆网| 亚洲天堂av无毛| 国产永久视频网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲第一av免费看| 国产一级毛片在线| 新久久久久国产一级毛片| 精品人妻在线不人妻| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| videos熟女内射| 国产69精品久久久久777片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 最后的刺客免费高清国语| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美另类一区| 九色成人免费人妻av| 极品人妻少妇av视频| 观看av在线不卡| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美日韩在线观看h| 男女啪啪激烈高潮av片| 伊人亚洲综合成人网| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 国产免费现黄频在线看| 亚洲,欧美,日韩| 熟女av电影| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 国产色婷婷99| 欧美97在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 欧美成人午夜免费资源| 久久久精品区二区三区| 少妇 在线观看| 久久久久网色| 国产亚洲精品久久久com| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品一区二区在线不卡| 一级a做视频免费观看| 日本wwww免费看| 免费观看a级毛片全部| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品,欧美精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 九九在线视频观看精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 在线精品无人区一区二区三| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美人与善性xxx| 麻豆成人av视频| 亚洲久久久国产精品| 久久狼人影院| 成人综合一区亚洲| 51国产日韩欧美| 免费看av在线观看网站| 高清在线视频一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免| 99热这里只有精品一区| 亚洲五月色婷婷综合| 美女cb高潮喷水在线观看| 免费观看的影片在线观看| 欧美日韩av久久| 精品人妻熟女av久视频| 99热这里只有是精品在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 另类精品久久| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久久久久久久久丰满| 少妇精品久久久久久久| 在线观看免费视频网站a站| 精品一品国产午夜福利视频| av视频免费观看在线观看| 熟女av电影| 人妻 亚洲 视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| a级片在线免费高清观看视频| 99re6热这里在线精品视频| 欧美+日韩+精品| 蜜桃在线观看..| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品.久久久| 黑丝袜美女国产一区| 三级国产精品欧美在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美精品一区二区免费开放| 成人国产麻豆网| 七月丁香在线播放| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 人人澡人人妻人| 国产高清有码在线观看视频| 久久午夜福利片| 国产成人aa在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 国产日韩欧美视频二区| 婷婷色av中文字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产淫语在线视频| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品视频女| 国产免费福利视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 特大巨黑吊av在线直播| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 少妇的逼水好多| 十八禁网站网址无遮挡| 欧美xxⅹ黑人| 久久99精品国语久久久| 亚洲av.av天堂| 有码 亚洲区| 黄色毛片三级朝国网站| 在现免费观看毛片| 热re99久久精品国产66热6| 一个人免费看片子| 国产精品国产av在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 插逼视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜av观看不卡| 少妇人妻久久综合中文| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 美女cb高潮喷水在线观看| 一级黄片播放器| 久久久久久久久久久丰满| 赤兔流量卡办理| 国产在线视频一区二区| 老司机影院毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 草草在线视频免费看| 欧美国产精品一级二级三级| 国产高清有码在线观看视频| 曰老女人黄片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久精品94久久精品| 国产精品女同一区二区软件| 日本欧美国产在线视频| 如何舔出高潮| 男女无遮挡免费网站观看| 99re6热这里在线精品视频| 九九在线视频观看精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚州av有码| 一级片'在线观看视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩av免费高清视频| 亚洲av日韩在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 国产免费又黄又爽又色| www.av在线官网国产| 寂寞人妻少妇视频99o| 黄片无遮挡物在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 国产综合精华液| 日韩欧美精品免费久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美成人精品欧美一级黄| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品国产亚洲av涩爱| 我的老师免费观看完整版| 日本wwww免费看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 人人澡人人妻人| 午夜激情av网站| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产伦理片在线播放av一区| 免费观看在线日韩| 亚洲国产av新网站| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 久久精品国产亚洲av涩爱| .国产精品久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 丝袜美足系列| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久婷婷青草| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 最近的中文字幕免费完整| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲精品视频女| 美女国产视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲国产日韩一区二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩在线高清观看一区二区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 日韩中文字幕视频在线看片| 免费大片18禁| 丝袜脚勾引网站| 久久久久网色| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲国产精品999| 成人毛片60女人毛片免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产亚洲最大av| 国产片特级美女逼逼视频| 新久久久久国产一级毛片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av播播在线观看一区| 国产精品欧美亚洲77777| 一级毛片我不卡| 亚洲av不卡在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品 国内视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 一级二级三级毛片免费看| 久久精品夜色国产| 伊人久久国产一区二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 熟女电影av网| 亚洲美女视频黄频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产 精品1| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91精品国产九色| 午夜福利,免费看| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品色激情综合| videossex国产| 人妻系列 视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 五月开心婷婷网| 街头女战士在线观看网站| 男女高潮啪啪啪动态图| 99久久精品国产国产毛片| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲精品一二三| 男女免费视频国产| 各种免费的搞黄视频| 午夜福利影视在线免费观看| 自线自在国产av| 亚洲,欧美,日韩| 黄片无遮挡物在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产在线一区二区三区精| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 大香蕉久久成人网| 久久ye,这里只有精品| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜福利视频在线观看免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 大香蕉久久成人网| 伦理电影免费视频| 大香蕉97超碰在线| 三上悠亚av全集在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 26uuu在线亚洲综合色| 99九九线精品视频在线观看视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| h视频一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜老司机福利剧场| 国产乱人偷精品视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲美女视频黄频| 免费观看性生交大片5| 国产精品蜜桃在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 国产黄频视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 热re99久久国产66热| 乱人伦中国视频| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲国产av影院在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 伦理电影大哥的女人| 久久精品国产自在天天线| 美女福利国产在线| 99久久人妻综合| 免费大片黄手机在线观看| 久久久久久久久大av| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久a久久爽久久v久久| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品人妻久久久影院| 午夜福利影视在线免费观看| 国产色婷婷99| 国产免费福利视频在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产色片| 免费看不卡的av| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产亚洲最大av| 韩国高清视频一区二区三区| 人妻一区二区av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 伊人久久国产一区二区| 大陆偷拍与自拍| 五月玫瑰六月丁香| 欧美日韩av久久| 久久婷婷青草| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久99蜜桃精品久久| 中文字幕av电影在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产有黄有色有爽视频| 97超视频在线观看视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲性久久影院| 草草在线视频免费看| 99久国产av精品国产电影| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲av国产av综合av卡| 色视频在线一区二区三区| 另类精品久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 夜夜爽夜夜爽视频| 午夜日本视频在线| 久久青草综合色| videos熟女内射| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 97在线视频观看| 999精品在线视频| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av男天堂| 五月天丁香电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 视频区图区小说| 老司机亚洲免费影院| 97超碰精品成人国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 少妇精品久久久久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 黄色怎么调成土黄色| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产视频内射| 久久久久国产网址| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲无线观看免费| 亚洲伊人久久精品综合| 精品人妻熟女av久视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 99热网站在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 蜜桃在线观看..| 草草在线视频免费看| 亚洲av免费高清在线观看| kizo精华| 少妇人妻久久综合中文| 97精品久久久久久久久久精品| 十八禁网站网址无遮挡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 少妇熟女欧美另类| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲综合色网址| a级毛色黄片| 色94色欧美一区二区| 欧美精品国产亚洲| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品欧美亚洲77777| 晚上一个人看的免费电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 色哟哟·www| 晚上一个人看的免费电影| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男女高潮啪啪啪动态图| 性色av一级| 免费av不卡在线播放| 亚洲综合色网址| 免费看av在线观看网站| 国产精品久久久久久久电影| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美成人午夜免费资源| 国产成人精品久久久久久| 一级二级三级毛片免费看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 97超碰精品成人国产| 亚洲国产精品专区欧美| 水蜜桃什么品种好| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲综合色惰| 国产精品国产三级国产专区5o| 老司机影院毛片| av一本久久久久| av黄色大香蕉| 美女大奶头黄色视频| 99久久综合免费| 两个人免费观看高清视频| 最新中文字幕久久久久| 欧美日韩av久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 精品亚洲成国产av| 一区二区三区精品91| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 伊人久久精品亚洲午夜| 在线观看三级黄色| 欧美亚洲日本最大视频资源| 男的添女的下面高潮视频| 久久青草综合色| 黄色欧美视频在线观看| 一区在线观看完整版| 男人爽女人下面视频在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 大片电影免费在线观看免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产永久视频网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 秋霞伦理黄片| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 免费黄频网站在线观看国产| 69精品国产乱码久久久| videosex国产| 日韩成人伦理影院| 亚洲综合色惰| 欧美3d第一页| 交换朋友夫妻互换小说| 一级毛片我不卡| 日韩成人伦理影院| 日韩中文字幕视频在线看片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女大奶头黄色视频| 亚洲综合精品二区| 黄色一级大片看看| av天堂久久9| 青春草视频在线免费观看| 一区二区av电影网| 韩国高清视频一区二区三区| 日本黄大片高清| 在线观看免费高清a一片| 热99久久久久精品小说推荐| 日日撸夜夜添| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产欧美亚洲国产| 精品一区在线观看国产| 国产色爽女视频免费观看| 99热国产这里只有精品6| 三级国产精品片| a级毛片在线看网站| 日韩免费高清中文字幕av| 黄色一级大片看看| 制服人妻中文乱码| 免费少妇av软件| 日韩大片免费观看网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品偷伦视频观看了| 最近手机中文字幕大全| 成人免费观看视频高清| 国产综合精华液| 国产av一区二区精品久久| 少妇的逼好多水| 精品久久久噜噜| 成人国语在线视频| 97在线人人人人妻| 亚洲av男天堂| 九九爱精品视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲人成网站在线播| 午夜av观看不卡| 久久99热6这里只有精品| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 交换朋友夫妻互换小说| 在现免费观看毛片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲成人av在线免费| 国产在视频线精品| 国产成人精品久久久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区 | 日日啪夜夜爽| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲成人手机| av黄色大香蕉| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久国产精品人妻一区二区| 色94色欧美一区二区| 777米奇影视久久| 伊人久久国产一区二区| 少妇人妻久久综合中文| 高清毛片免费看| 最黄视频免费看| 三级国产精品片| 男女边摸边吃奶| 下体分泌物呈黄色| 男女免费视频国产| 久久国内精品自在自线图片| 大陆偷拍与自拍| 美女内射精品一级片tv| 女性生殖器流出的白浆| 久久青草综合色| 欧美激情 高清一区二区三区| 97在线视频观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 最黄视频免费看| 国产精品久久久久久久久免| 街头女战士在线观看网站| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品国产三级专区第一集| 97精品久久久久久久久久精品| 美女大奶头黄色视频| av女优亚洲男人天堂| 久久人妻熟女aⅴ| 我要看黄色一级片免费的| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久鲁丝午夜福利片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 在线观看国产h片| kizo精华| 99九九线精品视频在线观看视频| 考比视频在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 蜜桃在线观看..| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产成人一区二区在线| 一级二级三级毛片免费看| 国产成人一区二区在线| 久久综合国产亚洲精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产精品人妻久久久久久| av天堂久久9| 麻豆成人av视频| 观看美女的网站| 亚洲久久久国产精品| 午夜免费鲁丝| 国产一区二区三区综合在线观看 | 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品一二三| 久久久精品94久久精品| 精品一品国产午夜福利视频| 夫妻午夜视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色婷婷av一区二区三区视频| 高清在线视频一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频| 日日啪夜夜爽| 99热网站在线观看| 丝袜喷水一区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久99一区二区三区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一级,二级,三级黄色视频| a级毛片黄视频| 亚洲精品自拍成人| 少妇熟女欧美另类| 国产精品成人在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲图色成人| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品视频人人做人人爽| 久久ye,这里只有精品| 麻豆成人av视频| 在线观看免费高清a一片| 99国产综合亚洲精品| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 青春草国产在线视频| 国产 一区精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美3d第一页| 亚洲精品日韩av片在线观看|