葡萄糖甘氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對脂肪氧合酶的抑制作用研究

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(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院,安徽合肥 230009; 安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230009)

脂肪氧合酶(Lipoxygenase,EC l. 13. 11. 12,簡稱LOX),是一種含非血紅素鐵的氧化還原酶,可專一催化含順,順 - 1,4 - 戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸(或酯),產(chǎn)生共軛不飽和脂肪酸氫過氧化物[1]。LOX廣泛存在于動植物界中,豆科植物中具有較高活力,在大豆中含量最高。LOX催化產(chǎn)物氫過氧化物可以進一步裂變形成醛、酮等二級氧化產(chǎn)物或者是經(jīng)氧化生成環(huán)氧酸,這些氧化產(chǎn)物可導致油脂和含油食品在加工和儲藏過程中色、香、味的劣變[2],以及大豆與豆制品產(chǎn)生豆腥味[3]。目前,LOX的抑制劑主要是化學試劑(如BHA、BHT、NaN3等)以及天然提取抗氧化物(如兒茶素、黃酮類、花青素等)[4],這些抑制劑制取繁瑣,成本大。

美拉德反應(yīng)(Maillard reaction,MR),又稱非酶褐變反應(yīng),指的是氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))與羰基化合物(糖類)經(jīng)過一系列復雜反應(yīng),生成還原酮、含氮含硫雜環(huán)化合物以及類黑精等產(chǎn)物的過程[5]。20世紀80年代以來,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)由于具有較強抗氧化性而備受關(guān)注。其對一些氧化還原酶如多酚氧化酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶等具有較強抑制作用[6 - 9],但對LOX的影響還未見報道。本文以亞油酸作為酶反應(yīng)底物,研究了Glu/Gly - MRPs對LOX的抑制作用及機理,為拓展MRPs的應(yīng)用,開發(fā)LOX天然抑制劑提供了理論依據(jù)。

西藏自治區(qū)財政性教育經(jīng)費的投入從2010的63.35億元上升到2016年的175.83億元，凈增長112.48億元。同時，教育經(jīng)費占地區(qū)生產(chǎn)總值的比重也在呈現(xiàn)增長趨勢。見表2。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕 購于河南漫天雪蛋白有限公司;亞油酸 購自成都格雷西亞化學技術(shù)有限公司;甘氨酸 購自于北京索萊寶科技有限公司;硫酸銨、葡萄糖、氫氧化鈉、硼酸、無水乙醇等 購于國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

數(shù)字恒溫水浴鍋HH - 4 國華電器有限公司;手提式蒸汽滅菌鍋SYQ. DSX - 280B 上海申安醫(yī)療器械廠;pH計PHS - 3C 上海儀電科學儀器股份有限公司;可見光分光光度計721G 上海精科儀器有限公司;紫外分光光度計UV1201 北京瑞利分析儀器公司;分析天平CP114 奧豪斯儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司。

1. 2. 5. 3 具體測定方法是 實驗組:取0. 2mL一定濃度的LOX酶液于試管中,加入MRPs 50μL,30℃水浴恒溫靜置30min后,加入1. 5mL亞油酸底物,混勻,30℃水浴恒溫反應(yīng)3min,加入5mL無水乙醇終止反應(yīng),最后加入5mL蒸餾水稀釋,在234nm下測定吸光值?？瞻捉M:在加入底物前添加5mL無水乙醇使酶失活。

1. 2 實驗方法

1. 2. 7 數(shù)據(jù)處理方法 所有實驗每個樣做3個平行,實驗結(jié)果取平均值,采用Excel及origin軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

1. 2. 2 MRPs的制備 取一定體積0. 5mol/L的葡萄糖水溶液至具塞三角瓶中,加入等體積的一定濃度的甘氨酸水溶液,調(diào)整溶液初始pH(加熱反應(yīng)過程中不調(diào)整pH)。蓋緊塞子防止加熱過程中水蒸氣的蒸發(fā),在蒸汽式滅菌鍋中進行反應(yīng)。以甘氨酸濃度、初始pH、反應(yīng)溫度和時間為單因素制備不同的MRPs。制備好的MRPs置于4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 褐變程度的測定 將樣品稀釋一定倍數(shù)后,以蒸餾水為對照組調(diào)零,測定樣液在420nm處的吸光值。

1. 2. 2. 2 不同初始pH的MRPs的制備 控制甘氨酸濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間分別為0. 6mol/L、110℃和4h,調(diào)初始pH分別4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0制備MRPs。

2.涉及油田的行政事業(yè)性收費被取消。2011年12月財政部、發(fā)改委發(fā)布《關(guān)于公布取消253項涉及企業(yè)行政事業(yè)性收費的通知》（財綜〔2011〕127號）。其中，如山東省財政廳、物價局轉(zhuǎn)發(fā)了該文件，取消了19項涉企行政事業(yè)性收費，其中取消了涉及勝利油田的落地原油管理費、工農(nóng)工作協(xié)調(diào)費、水工程占用補償費、石油勘探開發(fā)排污費等有12項費用，進一步緩解了油田生產(chǎn)經(jīng)營壓力。

1. 2. 2. 3 不同反應(yīng)溫度的MRPs的制備 控制甘氨酸濃度、初始pH和反應(yīng)時間分別為0. 6mol/L、7. 0和4h,分別在80、90、100、110、120℃下制備MRPs。

1. 2. 2. 4 不同反應(yīng)時間的MRPs的制備 控制甘氨酸濃度、初始pH和反應(yīng)溫度分別為0. 6mol/L、7. 0和110℃,反應(yīng)0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、3. 0、4. 0、6. 0h制備MRPs。

1. 2. 3 反應(yīng)產(chǎn)物pH的測定 取一定反應(yīng)液,快速冷卻至室溫后,用pH計測定pH。

1. 2. 2. 1 不同甘氨酸濃度的MRPs的制備 控制初始pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間分別為7. 0、110℃和4h,取0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0mol/L的甘氨酸溶液分別制備MRPs。

1. 2. 5 LOX活性抑制測定(分光光度法[11])

還需提及，南海區(qū)域也是日本拓展地緣政治影響力的重要場域。對于日本而言，東北亞因有俄羅斯、中國等大國的存在，所以其主要的地緣政治空間首選南海及周邊東南亞地區(qū)。在南海周邊地區(qū)，日本更希望維持美軍存在基礎(chǔ)上的美日同盟安保秩序，不愿看到其他國家主導這一海域，因為這將大大削弱日本在南海區(qū)域地區(qū)事務(wù)中的角色，因此對中國在南海海域的維權(quán)行動視為“威脅”，并逐步升級實施“對華對沖戰(zhàn)略”。[20]

1. 2. 5. 2 酶活定義 把30℃,pH9. 0下,以亞油酸為底物的3mL反應(yīng)體系在234nm處每分鐘增加0. 001吸光度值定義為一個酶活單位。

跨越三個世紀的商務(wù)印書館，在現(xiàn)代文化史上確是一個傳奇之存在，就印刷領(lǐng)域而言，憑借著“第一個采用珂羅版印刷”“第一個采用電鍍銅版印刷”“第一個使用自動鑄字機”“第一個采用膠版彩色印刷”等不可忽視之所為，似乎走出了現(xiàn)代印刷的發(fā)展軌跡。而幾經(jīng)改名、改制所成就的今日之商務(wù)印書館上海印刷股份有限公司（以下簡稱“商務(wù)公司”），亦以百年沉淀續(xù)寫著印刷未來之無限可能。當坐在我們面前的商務(wù)公司總經(jīng)理蔣樹新，在談及過往之榮耀與未來之暢想時，一種作為商務(wù)人固有的榮譽感與責任感呼之欲出。

鎮(zhèn)海煉化公司1 Mt乙烯裝置裂解氣壓縮機采用美國通用電氣公司的壓縮機，機組體積大、結(jié)構(gòu)復雜，分別由低壓、中壓、高壓3缸五段串聯(lián)組成，具有壓比高、流量大等特點，驅(qū)動機的額定功率達到60.28 MW，是目前中國功率最大的裂解氣壓縮機組之一，在整個乙烯裝置起著關(guān)鍵作用；該壓縮機將急冷水塔送來的0.031 MPa，40 ℃裂解氣，經(jīng)五段壓縮后，將壓力提高到4.026 MPa，為深冷分離提供條件。壓縮機控制流程主要包括： 供油系統(tǒng)、干氣密封系統(tǒng)、盤車裝置及壓縮機組啟?？刂?。

抑制率(%)=(不加抑制劑吸光值 - 加抑制劑吸光值)/不加抑制劑吸光值×100

1. 2. 6 抑制動力學的研究 在1. 2. 2的基礎(chǔ)上,取0. 6mol/L甘氨酸溶液在初始pH為7. 0,110℃下與等體積0. 5mol/L葡萄糖溶液反應(yīng)4. 0h制備MRPs。取制備的MRPs加蒸餾水配制成體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%的MRPs稀釋液,分別取50μL上述4種MRPs稀釋液、蒸餾水(MRPs濃度為0)以及MRPs樣液(濃度為100%)添加到酶促反應(yīng)體系中,跟蹤OD234的變化,計算反應(yīng)速率,進行遲滯曲線繪制及抑制動力學的研究。

2 結(jié)果與討論

2. 1 不同甘氨酸濃度合成的Glu/Gly - MRPs的pH、褐變程度以及對LOX的抑制率分析

圖1 甘氨酸濃度對Glu/Gly - MRPs的最終pH和褐變程度的影響Fig. 1 Effect of glycine concentration on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

MR的主要終極產(chǎn)物—類黑精在420nm下具有最大吸光值,因此該波長下的吸光值也是反應(yīng)進行程度的表征,被廣泛用來衡量產(chǎn)物的褐變程度[12 - 13]。由圖1可知隨著甘氨酸濃度的增大,Gly/Glu - MRPs的pH呈下降趨勢,褐變程度呈先緩慢上升后急劇加快的趨勢。這是由于甘氨酸的堿性基團 - 氨基在加熱的過程中不斷地與還原糖的羰基進行縮合,使得游離的氨基被封閉,同時生成的有機酸,致使體系的pH不斷下降[14]。同時甘氨酸濃度越大,反應(yīng)越完全,終產(chǎn)物黑色素越多。

路上，他如常地看報紙，卻不再專心，總是抬頭來偷看她，與她對話。她就淡淡地應(yīng)著，然后她接到他的邀約：晚上一起吃飯。

由圖2可知隨著甘氨酸濃度的增大,MRPs對LOX的抑制率增大,當甘氨酸濃度到達0. 6mol/L時抑制率達到87. 1%,高于0. 6mol/L之后抑制率變化不大,因此后續(xù)實驗選取0. 6mol/L作為Glu/Gly -MRPs制備濃度。

圖2 不同甘氨酸濃度合成的Glu/Gly - MRPs對LOX的抑制率Fig. 2 Effect of glycine concentration on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 2 不同初始pH合成的Glu/Gly - MRPs的pH、褐變程度以及對LOX的抑制率分析

由圖3可知Glu/Gly - MRPs的最終pH均較初始pH有所降低,且隨著初始pH的增大,pH下降幅度越明顯。褐變程度呈先緩慢上升后急劇加快的趨勢。這與Ajandouz等[15]的結(jié)果一致。這是由于中性和堿性條件下,氨基陰離子的存在使得羰氨反應(yīng)更容易進行。

圖3 初始pH對Glu/Gly - MRPs的最終pH和褐變程度的影響Fig. 3 Effect of initial pH on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

由圖4可知隨著反應(yīng)體系初始pH的增加抑制率增大,當初始pH達到7. 0時抑制率趨于平穩(wěn),pH為9. 0時,抑制率達到99. 8%,考慮到實際情況中,LOX酶促反應(yīng)在中性條件居多,因此后續(xù)實驗選取7. 0為反應(yīng)初始pH制備MRPs。堿性條件下生成較多的褐色物質(zhì),這些都可能是具有LOX抑制活性的物質(zhì)。

圖4 不同初始pH合成的Glu/Gly - MRPs對LOX抑制率Fig. 4 Effect of initial pH on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 3 不同反應(yīng)溫度合成的MRPs的pH、褐變程度以及對LOX的抑制率分析

由圖5可知隨著反應(yīng)溫度的升高,Glu/Gly -MRPs的最終pH降低,A420在80 ～ 100℃范圍非常小且?guī)缀鯖]有變化,110 ～ 120℃急劇上升。這說明高溫下反應(yīng)速度大為加快,美拉德反應(yīng)更加徹底。該結(jié)果與吳惠玲等[16]一致。

1. 2. 5. 1 底物的配制 將0. 25mL吐溫20分散于10mL pH為9. 0的0. 2mol/L硼酸緩沖液中再加入0. 27mL亞油酸,充分混合,加入1mol/L的氫氧化鈉使體系澄清,調(diào)節(jié)pH為9. 0,然后用上述硼酸緩沖液稀釋到500mL作為底物待用。

圖5 反應(yīng)溫度對Glu/Gly - MRPs的最終pH和褐變程度的影響Fig. 5 Effect of reaction temperature on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

由圖6可以看出隨著溫度的升高抑制率上升。當反應(yīng)溫度處于80到100℃時,雖然褐變程度低且變化不大,但是抑制率仍上升較快,110 ～ 120℃抑制率趨于平穩(wěn),可選取110℃為最佳反應(yīng)溫度。分析其原因為:低溫時生成小分子量的產(chǎn)物[17],這種小分子量的物質(zhì)對LOX也有一定的抑制作用。當溫度高于110℃時,大分子的聚合物在LOX的抑制中起到主要作用。

那天公司完成了一個大項目，白陽提議去吃飯慶祝。飯桌上何冰快樂得不得了，對白陽說：“我們倆的合作簡直就是雙劍合璧，天下無敵?！?/p>

圖6 不同反應(yīng)溫度合成的Glu/Gly - MRPs對LOX抑制率Fig. 6 Effect of reacting temperature on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 4 不同反應(yīng)時間生成的MRPs的pH、褐變程度以及對LOX的抑制率分析

美拉德反應(yīng)在初級階段,反應(yīng)只要生產(chǎn)無色無味小分子物質(zhì),高級階段繼還原糖、糠醛和不飽和羰基化合物產(chǎn)生后開始形成無氮和含氮褐色可溶性化合物,最終階段中,前兩個階段形成的物質(zhì)繼續(xù)與氨基酸反應(yīng)生成類黑精色素 - 褐色含氮色素[18]。因此隨著美拉德反應(yīng)時間的延長,Glu/Gly - MRPs的褐變程度加強。由圖7可知隨著反應(yīng)時間的延長,Glu/Gly - MRPs的最終pH降低,褐變程度呈上升趨勢。反應(yīng)產(chǎn)物對LOX的抑制率在反應(yīng)時間大于3h后趨于平穩(wěn),抑制作用趨于飽和,因此選取3h作為最佳反應(yīng)時間。美拉德反應(yīng)時間越長,反應(yīng)體系里面的類黑精以及還原酮等具有抑制活性的物質(zhì)越多。

圖7 反應(yīng)時間對Glu/Gly MRPs的最終pH和褐變程度的影響Fig. 7 Effect of reacting time on final pH and browning degree of Glu/Gly - MRPs

圖8 不同反應(yīng)時間生成的Glu/Gly - MRPs對LOX抑制率Fig. 8 Effect of reacting time on inhibition rate of Glu/Gly - MRPs

2. 5 抑制動力學研究

不同Glu/Gly - MRPs濃度下,酶反應(yīng)的進程曲線如圖9。由圖9可看出在相同反應(yīng)時間下,反應(yīng)液的吸光度隨著MRPs的濃度的增大有所下降。遲滯時間為進程曲線的直線部分相交于橫軸的值,MRPs的濃度和遲滯時間關(guān)系如表1。Glu/Gly - MRPs對LOX具有明顯的遲滯效應(yīng),酶反應(yīng)遲滯時間由不添加MRPs的64s延長至173s,遲滯時間隨著MRPs的濃度的增大而增大。

圖9 不同濃度Glu/Gly - MRPs(v/v)對LOX抑制作用的進程曲線Fig. 9 Progress curves for inhibition against LOX by Glu/Gly - MRPs

本研究進一步探討了Glu/Gly - MRPs對LOX的抑制類型。通過改變底物亞油酸的濃度,測定酶在不同MRPs濃度作用下的催化活力得出Lineweaver -Burk雙倒數(shù)圖如圖10所示。各MRPs濃度下雙倒數(shù)擬合方程、米氏常數(shù)(Km)和最大速度(vm)如表2所示,vm隨著Glu/Gly - MRPs的濃度增大而減小,Km隨著Glu/Gly - MRPs的濃度的增大而增大,由此判斷該抑制作用屬于混合型。

表1 Glu/Gly - MRPs對LOX遲滯時間的影響Table 1 Effect of Glu/Gly - MRPs on the lag time of LOX

圖10 Glu/Gly - MRPs對LOX抑制的Lineweaver - Burk圖Fig. 10 Lineweaver - Burk plots for inhibition of Glu/Gly - MRPs on LOX

混合型抑制的Lineweaver - Burk雙倒數(shù)方程形式為:

我國經(jīng)濟的高速發(fā)展對電能的數(shù)量和質(zhì)量提出了更高的要求，致使電力調(diào)度問題被推上輿論的風口浪尖。實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)在電力調(diào)度工程中的應(yīng)用，不僅是信息時代發(fā)展的要求，更是我國經(jīng)濟發(fā)展邁上新臺階的要求。雖然網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的普及誘發(fā)了一系列的信息安全問題，但實現(xiàn)電力調(diào)度的信息化是利國利民的舉措。

其中,KI為抑制劑對游離酶的抑制常數(shù),KIS為抑制劑對酶 - 底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)。二次作圖,以雙倒數(shù)圖的斜率和縱軸截距對MRPs濃度作圖為直線,分別求出MRPs的KI為16. 41mmol/L,KIS為13. 83mmol/L?；旌闲鸵种普f明LOX催化亞油酸氧化過程中,Glu/Gly - MRPs不僅能與游離LOX結(jié)合,還能與LOX - 亞油酸絡(luò)合物結(jié)合。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明,Glu/Gly - MRPs對LOX具有較強抑制作用,并且抑制作用隨著反應(yīng)中甘氨酸濃度、反應(yīng)初始pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的增大而增強,等體積0. 6mol/L的甘氨酸溶液與0. 5mol/L葡萄糖溶液在初始pH為9. 0,110℃下反應(yīng)3h制備的MRPs對LOX的抑制率達99. 8%。Glu/Gly - MRPs對LOX酶催化反應(yīng)有明顯的遲滯效應(yīng),雙倒數(shù)圖表明抑制作用為混合型抑制。

表2 Glu/Gly - MRPs對LOX的抑制動力學參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of LOX inhibited by Glu/Gly - MRPs

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