熱穩(wěn)定性脂肪酶生產(chǎn)菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究

王 穎，陳吉祥，王 冰，楊 智，李彥林，劉元利，張慶芳

（蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州 730050）

脂肪酶（EC.3.1.1.3）又稱三酰甘油酰基水解酶，是一類水解長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯生成脂肪酸和甘油的界面酶，可催化油脂的選擇性水解及其它酯類的轉(zhuǎn)酯、氨解等反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于食品加工、新型生物材料合成、精細(xì)化工、去污劑、皮革加工和造紙等諸多領(lǐng)域［1－2］。由于在非水相體系中具有良好的酯化、轉(zhuǎn)酯、醇解和氨解特性，脂肪酶還被廣泛用于不對(duì)稱合成，外消旋體拆分制備手性化合物等，在藥物合成領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景［3－4］，20世紀(jì) 90年代許多學(xué)者開(kāi)始研究用生物酶法制備生物柴油，開(kāi)發(fā)出多種脂肪酶代替化學(xué)催化劑化學(xué)轉(zhuǎn)化的過(guò)程［5－6］。

脂肪酶廣泛存在動(dòng)物、植物和微生物中。而微生物來(lái)源的脂肪酶種類最多，廣泛存在于細(xì)菌、酵母和霉菌中，易于大規(guī)模生產(chǎn)，具有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的pH、溫度適應(yīng)性，因此是工業(yè)用脂肪酶的重要來(lái)源。目前已報(bào)道產(chǎn)脂肪酶的真菌主要有黑曲霉（Aspergillusspp.）、毛 霉 （Mucorspp.）、少 根 根 霉（Rhizopus arrhizus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）、南極假絲酵母（Candida antarctica）、柱狀假絲酵母（Candida cylindracea）等。產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌包括無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、色桿菌（Chromobacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）［7－8］。脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選工作國(guó)內(nèi)也有大量相關(guān)研究，但仍缺少工業(yè)化應(yīng)用的產(chǎn)品。國(guó)外脂肪酶價(jià)格昂貴，尋找活性高、穩(wěn)定性好、易分離純化的脂肪酶就成為促進(jìn)酶法生產(chǎn)生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的研究熱點(diǎn)。本文從含油廢水、農(nóng)田以及被石油污染的土壤等不同來(lái)源樣品中篩選得能產(chǎn)生脂肪酶的菌株并進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，酶學(xué)性質(zhì)的研究，為脂肪酶的應(yīng)用提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

土樣 采自甘肅不同地區(qū)農(nóng)田、油脂污染及石油污染土壤;供分離用蛋白胨、酵母粉、Tween－80等 均為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純;對(duì)硝基苯丁酸酯（4－Nitrophenyl butyrate） 天津希恩思生化科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、dNTP、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶等 大連寶生物工程有限公司;DNA凝膠回收純化試劑盒 天根生物工程有限公司;脂肪酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基 蛋白胨 10.0g/L，CaCl2·H2O 0.5g/L，NaCl 10.0g/L，瓊脂 15.0g/L，1%Tween－80，pH7.0;LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨 10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH7.0。

UV－2102PC分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司;IS－RDH2恒溫振蕩器 美國(guó)精騏有限公司;Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司;TC－96/G/H基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司;Tanon－3500凝膠圖像處理系統(tǒng) 上海天能科技有限公司;MA99－2A自動(dòng)液相色譜分離層析儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;VE－180垂直電泳儀 上海天能科技有限公司;TRACE DSQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)熱電公司。

1.2 脂肪酶產(chǎn)生菌株篩選及鑒定

稱取 10.0g土樣加入到 100mL無(wú)菌水中，150r/min振蕩培養(yǎng)3～4h，使土樣中細(xì)菌分散于水中，靜置30min。取上清液涂于脂肪酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌落周圍暈圈產(chǎn)生情況，挑選暈圈明顯的單菌落，經(jīng)多次分離純化得到脂肪酶產(chǎn)生菌株。對(duì)具有酶活性的菌株再接種于液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用橄欖油乳化法［9］和對(duì)硝基苯酚法［10］測(cè)定脂肪酶活性，篩選出產(chǎn)酶能力高的菌株，－80℃保存。

將篩選菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h，進(jìn)行菌落形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色等，進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察，并分析生理生化特性，提取細(xì)菌基因組 DNA，采用16S rDNA通用引物（27F:5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG － 3′ 1492R:5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3 ′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將所得樣品送生工生物工程公司測(cè)序，將所得的16S rDNA 序 列 與 NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）庫(kù)中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 酶活力測(cè)定

脂肪酶能水解對(duì)硝基苯丁酸酯（4－Nitrophenyl butyrate）底物生成丁酸和對(duì)硝基苯酚，后者是一種黃色物質(zhì)在410nm下有光吸收［10］。通過(guò)測(cè)定酶催化反應(yīng)生成的黃色對(duì)硝基苯酚的量來(lái)計(jì)算酶活力。具體條件為:1.9mL 反應(yīng)基質(zhì)溶液（1.5% 阿拉伯膠、2%Triton X －100、0.3mg/mL 對(duì)硝 基 苯 丁 酸 酯 溶 于50mmol Tris－HCl中）和100μL脂肪酶的混合物反應(yīng)體系，40℃下水浴10min后，410nm下測(cè)光吸收值。酶活力單位的定義（U）:在給定條件下，每小時(shí)釋放0.1μmol p－對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為1U。

1.4 菌株的生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

將篩選所得菌株接種到LB培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在不同時(shí)間取發(fā)酵液，測(cè)菌液OD600確定菌株生長(zhǎng)曲線，10000r/min離心10min，取上清液測(cè)定脂肪酶活力，確定菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間。在不同溫度下培養(yǎng)，以確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度及最佳產(chǎn)酶溫度。設(shè)計(jì)不同初始pH，確定菌株最適生長(zhǎng)及最佳產(chǎn)酶初始pH，用相對(duì)酶活表示。

1.5 脂肪酶的分離純化

將篩選所得菌株接種到1000mL LB培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)36h，10000r/min離心10min，取上清液用80%飽和度的（NH4）2SO4進(jìn)行鹽析，將鹽析后的蛋白質(zhì)沉淀溶于pH7.2的Tris－HCl緩沖液中，透析脫鹽，將透析后的液體加樣于用20mmol/L pH8.5的Tris－HCl平衡好的DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子層析柱，用含0～0.6mol/L NaCl的相同緩沖液梯度洗脫，每0.1mol/L增加一個(gè)梯度進(jìn)行洗脫，流速控制在24mL/h，每管2mL收集洗脫液，測(cè)定蛋白吸收和酶活力，以酶活力單位U表示。洗脫程序?yàn)?0～9管0mol/L NaCl;10～41 管 0.1mol/L NaCl;42～82 管0.2mol/L NaCl;83～116 管 0.3mol/L NaCl;117～ 137管 0.4mol/L NaCl;138 ～ 149 管 0.5mol/L NaCl;150～160管 0.6mol/L NaCl。最后收集合并具有脂肪酶活性部分，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用 Bradford方法進(jìn)行［11］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 脂肪酶的SDS－PAGE電泳分析

蛋白酶的分子量測(cè)定采用SDS－PAGE垂直板電泳法:濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，考馬斯亮蘭R－250染色，其中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白包括磷酸化酶b、牛血清蛋白、卵清蛋白、碳酸苷酶、胰蛋白酶抑制劑、溶菌酶。

1.8 溫度對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

按1.3方法在不同溫度下測(cè)定酶活力，確定酶的最適溫度，另外將蛋白酶溶液于不同溫度保溫30min取樣并迅速冷卻到室溫，再測(cè)定酶的活力，確定溫度對(duì)酶穩(wěn)定性影響，用相對(duì)酶活表示。

1.9 pH對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

選取不同pH的緩沖液作為反應(yīng)體系中的緩沖液，其他條件不變，測(cè)定酶活力，確定該酶的最適作用pH。將酶溶液加入不同pH緩沖液中，4℃下保溫2h，測(cè)定酶活力，確定不同pH對(duì)酶穩(wěn)定性影響，用相對(duì)酶活表示。

1.10 脂肪酶催化合成生物柴油的初步研究

將 10.0mL 含 10.0mg 椰子油、10.0mg Tween－80的正己烷溶液與3.3mL 3%的MgSO4溶液攪拌制成乳濁液，再與10.0g硅藻土混合，干燥。稱出1.7g與2.0mL純化后的脂肪酶混合，室溫放置直至干燥［12－13］。50mL 具塞錐 形 瓶中加入 3.0g 橄 欖 油［14］，0.14mL 的甲醇（醇油摩爾比為 3∶1），5.0mL 正己烷，2.0g固定化脂肪酶，40℃密閉振蕩反應(yīng)，分3次流加甲醇，48h后用氣相色譜質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分析。

表1 菌株Mhy－1生理生化特性Table 1 Physiological characteristics of the strain Mhy－1

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及鑒定

采用平板透明圈法對(duì)不同地區(qū)來(lái)源的土樣進(jìn)行初篩，共獲得31株脂肪酶產(chǎn)生菌株，其中菌株Mhy－1具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)酶高且穩(wěn)定的特點(diǎn)，所產(chǎn)生的脂肪酶具有較好的熱穩(wěn)定性，所以后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選用Mhy－1進(jìn)行酶的生產(chǎn)及性質(zhì)的研究。該菌株菌落呈淡黃色，邊緣光滑整齊，表面濕潤(rùn)，細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏陰性，大小為（0.3～0.5）μm × （0.1～0.2）μm，無(wú)芽孢，其主要生理生化特性如表1。

采用16S rDNA通用引物從菌株Mhy－1基因擴(kuò)增獲得大小為1500bp左右的特異性片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送到生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，根據(jù)菌株16S rDNA序列同源性構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)（圖1），菌株Mhy－1的16S rDNA序列與殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）可聚為一類，結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)特性、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步確定其為殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）。

圖1 菌株Mhy－1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strain Mhy－1

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶活力的影響

將菌株Mhy－1接種到LB培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)得到的生長(zhǎng)曲線如圖2所示，該菌株在前10h生長(zhǎng)迅速，10h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株的最佳產(chǎn)酶時(shí)間為36h。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶活力的影響Fig.2 Effect of culture time on the growth of the strain and lipase production

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶活力的影響

將菌株Mhy－1接種到LB培養(yǎng)基中，不同培養(yǎng)溫度下菌株生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶活力的影響如圖3所示，其最佳生長(zhǎng)溫度及最佳產(chǎn)酶溫度分別為35、30℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶活力的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the growth of the strain and lipase production

2.4 初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶活力的影響

將菌株Mhy－1接種到不同初始pH的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株的最佳生長(zhǎng)初始pH 為 6.0～9.0 范圍，最佳產(chǎn)酶初始 pH 為 9.0（圖 4）。

2.5 脂肪酶的純化及性質(zhì)

菌株Mhy－1培養(yǎng)上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAESepharose fast flow陰離子交換層析兩步的分離純化，經(jīng)過(guò)DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子交換層析得到5個(gè)蛋白吸收峰，發(fā)現(xiàn)最大酶活在第二個(gè)蛋白峰和第三個(gè)蛋白峰處，脂肪酶最終純化倍數(shù)為7.25，最終的回收率為17.92%（圖5、表2）。

圖4 不同初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶活力的影響Fig.4 Effects of the initial pH on the growth of the strain and lipase production

圖5 DEAE－Sepharose Fast Flow層析柱Fig.5 Purification by DEAE－Sepharose Fast Flow

2.6 SDS－PAGE測(cè)定脂肪酶純度及分子量

用SDS－PAGE方法測(cè)定純化后脂肪酶的純度及其分子量，結(jié)果如圖6所示，最終純化得到的脂肪酶的電泳圖譜表現(xiàn)為單一條帶，分子量約為34ku。

圖6 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.6 SDS－PAGE analysis

表2 菌株Mhy－1脂肪酶的純化結(jié)果Table 2 Purification of lipase from Mhy－1

2.7 溫度對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

選取不同溫度進(jìn)行酶反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該酶最適作用溫度為45～50℃之間，在20℃與70℃失活，擁有較寬的溫度適應(yīng)范圍。在30～70℃均熱穩(wěn)定性良好，在50℃時(shí)，穩(wěn)定性最優(yōu)（圖7）。

圖7 溫度對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperature on the lipase activity and stability

2.8 pH對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響

純化的脂肪酶最適作用pH為8.0。且在堿性條件下也能發(fā)揮較高活力，酸性條件下失活。pH為8.0時(shí)，pH穩(wěn)定性最好，并且在堿性條件下適應(yīng)能力較強(qiáng)，判斷該脂肪酶為堿性脂肪酶（圖8）。

圖8 pH對(duì)脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of pH on the lipase activity and stability

2.9 脂肪酶催化合成生物柴油的初步研究

純化后脂肪酶與橄欖油、甲醇、正己烷在密閉容器中40℃振蕩反應(yīng)48h，收集上清液，用正己烷稀釋，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，轉(zhuǎn)酯率為21.48%，其中 12.91min（1.66%），15.28min（11.66%），16.24min（8.16%）。見(jiàn)圖 9。

3 結(jié)論與討論

生產(chǎn)脂肪酶的微生物種類繁多，不同種類的微生物產(chǎn)生的脂肪酶性質(zhì)有較大差異，常見(jiàn)的產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌有芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、伯克霍爾德菌 （Burkholderiaspp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcusspp.）。Ertugˇrul等分離了17株能產(chǎn)生脂肪酶的菌株，最后篩選得到一株芽孢桿菌（Bacillussp.），通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化后，產(chǎn)酶量可達(dá)168U/mL［15］;Kiran從海綿中分離到57株異養(yǎng)細(xì)菌，其中37%能產(chǎn)脂肪酶，假單胞菌（Pseudomonassp.）MSI057 產(chǎn)酶的能力可達(dá) 750U/mL［16］，Carvalho 等從石油污染的土壤中分離的一株Biopetro－4經(jīng)培養(yǎng)120h后產(chǎn)脂肪酶的能力為1675U/mL［17］。Abada等從空氣環(huán)境中分離的嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）AB－1在培48h后的產(chǎn)酶量為1585U/mL［18］。本文從含油廢水中篩選出一株活性較高的產(chǎn)堿性脂肪酶菌株Mhy－1，該菌在常規(guī)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)迅速，生長(zhǎng)適應(yīng)范圍廣，產(chǎn)酶穩(wěn)定。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生理生化以及16S rDNA序列分析，鑒定為殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）。該菌株具有生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)酶穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，其最適的生長(zhǎng)溫度和pH分別為35℃和pH7.0，而菌株的最佳產(chǎn)酶溫度和初始pH分別為30℃和 pH9.0，菌株在30℃培養(yǎng)10h后進(jìn)入穩(wěn)定期，最佳產(chǎn)酶時(shí)間為36h，純化后產(chǎn)酶能力可達(dá) 795.9U/mL。

采用硫酸銨沉淀、DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子層析從菌株Mhy－1的培養(yǎng)上清液中分離純化得到了較高活性的脂肪酶，SDS－PAGE測(cè)定酶的分子量為34ku。酶的最適作用溫度為45℃，最適作用pH8.0，在 pH7.0～9.0 之間都能較好的適應(yīng)，屬于堿性脂肪酶，在70℃處理30min后，酶活力仍保持在80%以上，表明該酶是一熱穩(wěn)定性的脂肪酶。Lee等從嗜熱噬油芽孢桿菌（Bacillus thermoleovorans）ID－1純化的脂肪酶分子量為34ku，酶最適溫度為70～75℃，最適pH為7.5，該酶在60℃保溫1h或70℃保溫30min后的活力為50%，Ca2+和 Zn2+對(duì)酶活性有促進(jìn)作用［19］。Tang等從凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）ZJU318分離的脂肪酶分子量為32ku，酶最適溫度為45℃，最適 pH9.0，在 pH7.0～10.0 的范圍內(nèi)穩(wěn)定，在40～50℃范圍內(nèi)酶迅速失活，Ag+、Cu2+對(duì)酶有抑制作用，SDS、Brij 30 和 Tween－80 能抑制酶活性［20］。

從氣單胞菌屬不同菌株來(lái)源的脂肪酶分子量分別為 15.5、26、31、34、45、50、72、80 和 97ku［21－23］。Neelambari等報(bào)道從嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）上清液中分離到分子量為34ku的堿性脂肪酶，酶在 pH7.5～9.5 和溫度 40～45℃ 范圍內(nèi)穩(wěn)定［22］。氣單胞菌（Aeromonassp.）LPB 4 脂肪酶的分子量為50ku，酶的最適溫度為10℃，在低于50℃的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，添加0.1%的表面活性劑能增加酶活力，而1%反而降低酶的活性，丁醇能降低酶活力而甲醇能增加酶的活力［21］。Lotrakul等從溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）LP004分離純化的脂肪酶分子量為97ku，酶的最適溫度為45℃，最適 pH6.0，在低于 40℃，pH6.5～10.0 的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定［24］。而從海水底泥分離的氣單胞菌（Aeromonassp.）EBB－1脂肪酶分子量為45ku，在pH8.0和37℃下活力最高，酶在 pH6.0～8.0 和 30～80℃ 范圍內(nèi)都比較穩(wěn)定［23］。Wang等從芽孢桿菌（Bacillussp.）A30－1分離的熱穩(wěn)定性脂肪酶在60℃時(shí)的活力最大，在70℃保持30min仍保持100%的酶活性。在60℃保持15h仍保持90%的酶活性［25］。其他熱穩(wěn)定性脂肪酶也有報(bào)道［26］。

用脂肪酶代替酸堿催化劑催化合成生物柴油的報(bào)道很多，酶催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)有反應(yīng)條件溫和、相對(duì)節(jié)能、環(huán)境友好、副產(chǎn)物易回收及適合高含量游離脂肪酸油脂作為底物等明顯優(yōu)勢(shì)［27－28］，可催化合成生物柴油的微生物脂肪酶包括細(xì)菌脂肪酶，真菌脂肪酶，固定 化 酶 Novozym435［29－30］等，包 括 洋 蔥 假 單 胞 菌（Pseudomonas cepacia）［31］，假絲酵母 （Candidasp.）99－125［32］，米根霉（Rhizopus oryzae）［33］，疏棉狀嗜熱絲孢 菌 （Thermomyces lanuginosus）［34］，產(chǎn) 氣 腸 桿 菌（Enterobacter aerogenes）［35］來(lái)源的脂肪酶都用于生物柴油的制備。優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的脂肪酶菌株對(duì)于酶的合成至關(guān)重要。本文將純化后的脂肪酶用于生物柴油的合成，轉(zhuǎn)酯率可達(dá)21.48%。由于該酶的穩(wěn)定性較好，會(huì)在將來(lái)的應(yīng)用中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，有關(guān)酶的基因表達(dá)及調(diào)控等有待于進(jìn)一步的研究。

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