功能性蛋黃肽的制備及體外活性研究

何 晨，王彥超，常耀光，薛長湖

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

作為禽蛋的生產(chǎn)大國，我國的雞蛋生產(chǎn)總量連續(xù)多年位居世界第一。2012年我國禽蛋產(chǎn)量達(dá)到2861萬t，占世界總產(chǎn)量的40%以上。盡管如此，我國市場上的蛋加工制品種類卻非常貧乏，絕大多數(shù)以帶殼鮮蛋的形式出售。僅有的幾種蛋加工產(chǎn)品也多是粗加工品（如蛋黃粉）。蛋黃富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、脂肪、鐵、鈣、磷、鋅和其他維生素等。

隨著生活水平提高，人們對于從自然生物中提取具有生物活性分子，應(yīng)用于人類健康和食品貯藏的需求越來越強(qiáng)烈［1］。研究顯示，在所有的生物活性分子中，生物活性肽具有很大的潛力。天然蛋白中的肽往往沒有生物活性，只有在經(jīng)過蛋白酶水解后才具有了多種生物活性［2］。在眾多的生物活性肽中，磷酸肽因其具有非常鮮明的結(jié)構(gòu)和活性，而成為一類具有很高研究價值的生物大分子物質(zhì)，高磷酸肽的主要功能基團(tuán)是磷酸肽絲氨酸殘基。而磷酸酞絲氨酸殘基可以與鈣離子有效結(jié)合，阻止不溶性的鈣磷酸鹽形成，從而提高生物價效［3］。

雖然目前國內(nèi)外對于從蛋黃中分離高磷蛋白及制備磷酸肽的研究已較多，但其制備方法得率相對較低，難以引入工業(yè)化的規(guī)模生產(chǎn)，例如徐彩娜等人采用雙酶分步水解法的最高得率也僅為11.49%［4］。本文試圖通過優(yōu)化蛋黃粉的脫脂過程和酶解過程，獲得一種優(yōu)質(zhì)蛋黃磷酸肽的制備工藝。同時以商業(yè)化產(chǎn)品酪蛋白磷酸肽（CPP）為對照，對本實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)物多肽的功能性質(zhì)和體外活性進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋黃粉 購自威海大豐實(shí)業(yè)有限公司;酪蛋白磷酸肽（CPP） 購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;DPPH、Ferrozine試劑 購自 Sigma－Aldrich;Alcalase 2.4L 購自諾維信生物有限公司;95%乙醇、正己烷、氯仿、甲醇、濃硫酸、鉬酸鈉、硫酸聯(lián)銨、硫酸銅、硫酸鉀、氯化亞鐵、氯化鈣等 均為國產(chǎn)分析純。

SG－4050C型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 上海碩光電子科技有限公司;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 東莞市立佳精密儀器有限公司;BSAZ23S－CW型電子天平Sartorius;TDL－5－A型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;3c starter通用型pH計(jì) 奧豪斯儀器上海有限公司;HJ－2型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋黃肽產(chǎn)品酶解工藝研究

1.2.1.1 工藝過程 蛋黃粉→脫脂→烘干→酶解→滅酶（100℃，10min）→離心取上清（5000r/min，10min）→噴霧干燥

1.2.1.2 脫脂 本文采用乙醇—正己烷脫脂:將蛋黃粉與95%乙醇按照（1/10，w/v）混合，室溫下攪拌提取30min，加入5倍體積的正己烷，室溫下攪拌提取6h，靜置 2h，抽濾，取濾渣，50℃烘干備用［5］。

1.2.1.2 酶解 粗蛋白按照（1/10，w/v）加蒸餾水，用一定濃度的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7，加入Alcalase 2.4L酶（E/S=4%），50℃恒溫水浴鍋中酶解5h。采用水解度（DH）值，即水解度，考察酶解過程中的蛋白質(zhì)的水解程度隨時間的變化情況。DH值的測定方法采用pH－Stat法［6］。測定方法如下:酶解的過程中，通過補(bǔ)加NaOH溶液，保持反應(yīng)體系的pH恒定為7。在特定的條件下，水解反應(yīng)的最終結(jié)果只與DH值有關(guān)，而在一定條件下，DH值與補(bǔ)加的NaOH體積成正比，水解度的計(jì)算公式如式1所示。

本研究以酪蛋白酸鈉為乳化劑，通過pH循環(huán)法制備丁香酚微乳，再通過海藻酸鈉對丁香酚微乳進(jìn)行修飾?？疾靸煞N微乳的粒徑分布、包封率、pH、離子、儲藏穩(wěn)定性及釋放特性。結(jié)果表明，海藻酸鈉修飾能提高丁香酚微乳平均粒徑，具有相當(dāng)丁香酚的包封率；海藻酸鈉修飾能夠顯著提高丁香酚微乳的pH穩(wěn)定性，且具有良好的離子和儲藏穩(wěn)定性；在環(huán)境pH為7.0條件下，海藻酸鈉修飾微乳的釋放速率稍高于丁香酚微乳。

式中:B為消耗NaOH體積;N為NaOH的摩爾濃度;α為平均解離度，0.44;m為被水解蛋白質(zhì)量;h為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，6.850。

1.2.1.3 二次酶解 為了使粗蛋白酶解的更完全，本研究采用兩次酶解的方法。第一次酶解的酶渣烘干后重復(fù)第一次酶解的過程。將兩次酶解產(chǎn)物進(jìn)行混合，計(jì)算整個酶解過程的酶解得率。

1.2.2 蛋黃肽的基本性質(zhì)測定

1.2.2.1 基本成分測定 灰分:按照國標(biāo)GB/T 5009.4－2010 中的方法測定［7］;蛋白質(zhì):采用國標(biāo)GB/T5009.5－2010 中的凱氏定氮法［8］;磷元素:采用鉬藍(lán)比色法［9］。

1.2.2.2 蛋黃肽在不同pH下的溶解度 分別稱取粗蛋白和蛋黃肽，配成濃度為1%的懸浮液或溶液，用10%鹽酸和4%氫氧化鈉分別調(diào)pH至2～10，室溫下振搖10min，使其溶解。2000r/min離心5min取上清。用Folin－酚法［10］測定可溶性蛋白，計(jì)算溶解度，公式如式2:

1.2.2.3 蛋黃肽的熱穩(wěn)定性 分別稱取粗蛋白，蛋黃肽和CPP，配成濃度為1%的懸浮液或溶液，于100℃水浴鍋中加熱30min，測定加熱前后420nm波長下的吸光度值。以吸光度值的變化作為衡量溶液熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。

1.2.3 蛋黃肽的體外活性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［12］，分別稱取一定量的粗蛋白，蛋黃肽和CPP，配制成濃度為1.0mg/mL的溶液。取該溶液200μL，加入甲醇600μL，0.15mmol/L 的 DPPH 溶液200μL，混勻2min，室溫條件下避光靜置，測定不同時間517nm波長處的吸光度值，同時做空白對照實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程同上。代入清除率計(jì)算式3，計(jì)算清除率:

1.2.3.3 金屬鐵離子螯合能力實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［12］，分別稱取一定量的粗蛋白，蛋黃肽和CPP，配制成濃度為1.0、2.0mg/mL的溶液。取該溶液200μL，加入2mmol/L 氯化亞鐵溶液10μL，超純水600μL，5mmol/L Ferrozine溶液 20μL，搖勻 2min，室溫下靜置 10min，測定562nm波長處的吸光度值。同時做空白對照和EDTA陽性對照實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝研究

由圖1可以看出，兩次酶解的酶解曲線形狀基本相同。在2h內(nèi)水解率增長迅速，隨后3h內(nèi)繼續(xù)增長但速率明顯減緩。對比兩次酶解過程水解度的變化情況，說明第二次酶解過程中水解度依舊較高，尤其是在反應(yīng)初始的1h內(nèi)，甚至超過第一次酶解過程的水解度。通過測定酶解后上清液中的固形物含量得出，第二次水解上清液的固形物含量為3.5%，與第一次水解上清液的3.9%幾乎相同，說明二次酶水解對提高產(chǎn)物的得率具有重要的貢獻(xiàn)。因此，從減低成本和充分利用資源的角度，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得蛋黃肽的制備工藝為:二次酶水解，水解時間3h。脫脂率為61.4%，酶解得率為41.0%。

2.2 蛋黃肽的基本性質(zhì)測定

2.2.1 樣品的灰分與蛋白質(zhì)含量 由表1可以看出，與粗蛋白相比，蛋黃肽的灰分含量有小幅增加，這是因?yàn)樵诿附膺^程中為了使pH保持在最佳酶活范圍內(nèi)，需要不斷添加堿造成的。雖然目前我國對以蛋黃為原料的多肽產(chǎn)品還沒有標(biāo)準(zhǔn)出臺，但是依據(jù)成分類似的大豆肽粉 GB/T22492－2008［13］中的規(guī)定，灰分在8%以內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)。蛋黃肽的蛋白含量為86.20%，依照大豆肽粉 GB/T22492－2008［14］中的規(guī)定，粗蛋白含量在85%以上，屬于二級質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2.2.2 樣品的磷含量 由表2得出，盡管2.1表明第二次酶解與第一次酶解的水解度相差無幾，但是所得的蛋黃肽的磷含量卻有大幅的降低，大量的磷被留在了酶渣中。磷含量減少而氮含量未明顯降低意味著N/P（摩爾比）比值升高。有研究表明［15］，N/P（摩爾比）越低，阻止磷酸鈣沉淀效果越好。因此，本實(shí)驗(yàn)對兩次水解所得產(chǎn)物的體外活性進(jìn)行了測定。

圖1 酶解過程中水解度的變化曲線Fig.1 Changes of hydrolysis degree with a function of reaction time

表1 樣品的蛋白質(zhì)和灰分含量測定結(jié)果Table 1 Determination of protein and ash content in the samples

表2 樣品的磷含量測定結(jié)果Table 2 Determination of phosphorus content in the samples

2.2.3 溶解度 能否在寬的pH范圍內(nèi)都有較好的溶解能力是產(chǎn)品的重要性質(zhì)。由圖2可以看出，酶解后粗蛋白的溶解度有了較大程度的提高。對于粗蛋白，溶液pH在2～10范圍內(nèi)，其溶解度分別處于5%～40%。對于蛋黃肽，溶液pH在2～10范圍內(nèi)，其溶解度均高于40%。溶解度的增大歸因于，蛋白經(jīng)過水解后親水性的離子化氨基和羥基的暴露。相比較而言，酶解的蛋黃肽的溶解度隨pH的變化更為明顯。pH=4時，溶解度最低（50%），此pH環(huán)境接近蛋黃肽的等電點(diǎn)。隨著pH的升高，其溶解度最高可達(dá)到90%以上，推測在較低pH時小肽之間容易聚合或生成小聚合物［14］。

圖2 pH對溶解度的影響Fig.2 Changes of solubility with a function of pH

2.2.4 熱穩(wěn)定性 產(chǎn)品是否具有較好的熱穩(wěn)定性，關(guān)系到該產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、貯藏過程中的多項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)。由圖3得出，在25℃和100℃條件下，酶解后的蛋黃肽產(chǎn)品較粗蛋白的熱穩(wěn)定性均顯著增加（p＜0.05）。100℃條件下，CPP與蛋黃肽產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性差異不顯著。所以在該產(chǎn)品的加工過程中，可以進(jìn)行有效的滅菌處理，而不必?fù)?dān)心產(chǎn)品性質(zhì)的變化。

圖3 不同產(chǎn)品的穩(wěn)定性測定結(jié)果Fig.3 Thermal stability determination of different samples

2.3 產(chǎn)品功能體外研究實(shí)驗(yàn)

2.3.1 阻止磷酸鈣沉淀的定性實(shí)驗(yàn) 由圖4得出，空白組和添加粗蛋白組，NaOH滴定量在15min之內(nèi)迅速上升到8mL，歸因于Ca2+與 PO3+4形成Ca3（PO4）2沉淀，說明粗蛋白不能阻止磷酸鈣沉淀的發(fā)生。而添加CPP組和添加蛋黃肽組，NaOH滴定量的突變時間變成了10～30min。說明添加CPP和蛋黃肽可以有效延遲Ca3（PO4）2沉淀的發(fā)生。Ca3（PO4）2沉淀生成的時間越遲，說明該樣品的持鈣能力越強(qiáng)。當(dāng)添加蛋黃肽的濃度達(dá)到0.2g/L時，Ca3（PO4）2最終沉淀量僅為空白樣品的1/3。

2.3.2 抗氧化性研究 由圖5得出，蛋黃肽的DPPH自由基清除率顯著高于粗蛋白和CPP的DPPH自由基清除率。隨著反應(yīng)時間的延長，蛋黃肽和CPP的DPPH自由基清除率均不斷增加。CPP的最高清除率僅為7%，不足蛋黃肽清除率的一半，而粗蛋白幾乎沒有DPPH自由基清除能力。

圖4 不同樣品阻止磷酸鈣沉淀效果測定結(jié)果Fig.4 Determination of calcium phosphate precipitation with the addition of different samples

圖5 樣品的DPPH清除率測定結(jié)果Fig.5 Determination of DPPH－scavenging abilities of different samples

與Fe2+的螯合能力是一種有效的評價物質(zhì)抗氧化活性的方法［16］。Fe2+由于具有很強(qiáng)的吸電子能力，能夠誘導(dǎo)自由基反應(yīng)的產(chǎn)生和傳播。Ferrozine試劑能與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生紅色的復(fù)合物，因此可以通過測定反應(yīng)液的吸光度值來計(jì)算其 Fe2+螯合能力［17］。結(jié)果如圖6，粗蛋白幾乎沒有亞鐵離子螯合能力，而CPP和蛋黃肽產(chǎn)品都有明顯的亞鐵離子螯合能力。無論是在1mg/mL還是2mg/mL濃度下，蛋黃肽產(chǎn)品都較CPP在亞鐵離子螯合能力方面有顯著提高。

圖6 樣品的亞鐵離子螯合能力測定結(jié)果Fig.6 Determination of Fe2+－chelating abilities of different samples

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所得蛋黃肽產(chǎn)品具有良好的體外抗氧化性，具有開發(fā)抗氧化產(chǎn)品的潛在價值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用Alcalase 2.4L兩次酶解經(jīng)乙醇－正己烷脫脂后的粗蛋白可以獲得高品質(zhì)蛋黃肽產(chǎn)品:得率為41%;蛋白含量大于85%，灰分低于8%;在較寬的pH范圍內(nèi)有較好的溶解性;熱穩(wěn)定性良好，可以進(jìn)行有效的熱滅菌處理。體外活性實(shí)驗(yàn)表明，蛋黃肽產(chǎn)品可以有效延緩和抑制磷酸鈣沉淀的發(fā)生，具有較好的DPPH自由基清除能力和亞鐵離子螯合能力，抗氧化性良好。本實(shí)驗(yàn)的工藝簡單，可以高效制備高品質(zhì)蛋黃肽，對蛋黃粉的有效利用和其加工制品的開發(fā)應(yīng)用具有重要的應(yīng)用價值。

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