9種海洋硅藻揮發(fā)性成分的比較分析

陳 姣，徐繼林，李 艷，周成旭，嚴小軍

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211)

海洋硅藻是一類單細胞藻類，種類多、數(shù)量大，被稱為海洋的“草原”，是海洋有機物的主要生產(chǎn)者之一，同時提供了約40%的海洋初級生產(chǎn)力[1]，在其生長過程中，揮發(fā)性組分可以通過海氣交換進入大氣，影響著局部甚至整個海域的氣候[2]。硅藻作為海洋經(jīng)濟動物貝類、蝦蟹幼體的直接餌料，其揮發(fā)性組分勢必直接影響著養(yǎng)殖生物的肉質(zhì)風味。研究表明，藻類代謝物直接影響著貝類對微藻的濾食速率和攝食選擇性，而這些代謝物相當部分為藻類揮發(fā)性組分[3]。另有研究表明在藻類中產(chǎn)生的某些短鏈醛與其自身防御及誘導撓足類的繁殖失敗密切相關[4]，所以有必要對海洋硅藻的揮發(fā)性組分進行詳細的研究?，F(xiàn)有對硅藻的研究中，人們主要關注其蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)效價[5,6]，對于藻類的揮發(fā)性成分的研究，目前只局限在大型藻上[7,8]，還未見對海洋微藻特別是海洋硅藻的揮發(fā)性成分的詳細研究。

本文借助頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(HS-SPME-GC/MS)，對9種海洋硅藻進行揮發(fā)性成分進行了測定，并利用SIMCA-P分析軟件對這些硅藻之間揮發(fā)性成分的差異進行詳細研究，可為海洋硅藻的進一步開發(fā)利用及其化學分類學、餌料營養(yǎng)學等相關研究提供重要參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

QP2010氣相色譜-質(zhì)譜分析儀，帶AOC-20自動進樣器(日本SHIMADZU公司)，vocol色譜柱(60 m×0.32 mm×0.18 μm，美國Supelco公司)，冷凍干燥機(美國LABCONCO公司)，固相微萃取(SPME)系統(tǒng)和75 μm DVB/ CAR/ PDMS萃取頭(美國Supelco公司)，顆粒粒度計數(shù)分析儀(德國Casy公司)，試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣品處理

9株海洋硅藻藻種由寧波大學海洋生物實驗室藻種室提供，分別為：角毛藻(Chaetoceroscalcitrons, NMBguh003-4)、冠盤藻(Stephanodiscusehrenberg,NMBguh017)、小硅藻(Nitzschiaclosterium,NMBguh002)、骨條藻(Skeletonemacostatum,NMBguh004-1)、骨條藻(Skeletonemacostatum,NMBguh004-2)、骨條藻(Skeletonemasp.,NMBguh004-3)、威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii,NMBguh021)、擬微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana,NMBguh005)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum, NMBguh001)，拉丁名后編號為對應硅藻在藻種室的編號。培養(yǎng)海水(鹽度25)經(jīng)0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾后煮沸冷卻，培養(yǎng)液采用“NML3號”配方(100 mg/L KNO3, 10 mg/L KH2PO4, 20 mg/L Na2SiO3, 0.25 mg/L MnSO4·H2O, 2.50 mg/L FeSO4·7H2O, 10 mg/L EDTA-Na2, 6 μg/L VB1, 0.05 μg/L VB12)。藻種在5000 mL錐形瓶中于日光燈光照下培養(yǎng)，每個樣品平行培養(yǎng)5瓶，光照強度45～55 μmol/(m·s)，光暗周期12∶12(h/h)，培養(yǎng)溫度為(20±2)℃，每2 d用顆粒粒度計數(shù)分析儀[9]測量硅藻密度，當小硅藻、角毛藻、威氏海鏈藻的生長到達平臺后期時在4℃、4000 r/min下對這3種硅藻離心收集；其余6種硅藻生長達到平臺后期時，在4℃、4000 r/min下離心收集。分析前，藻粉冷凍干燥后置于-80℃超低溫冰箱收藏。

稱取微藻樣品200 mg于15 mL SPME頂空瓶中，頂空瓶放置于30℃恒溫水浴中。75 μm DVB/ CAR/ PDMS萃取頭于氣相進樣口(210℃)老化30 min，用SPME裝置的針頭刺穿瓶蓋內(nèi)聚四氟乙烯密封墊，推出萃取頭暴露于頂空中，固定深度3 cm，萃取40 min，20℃室溫下平衡20 min，取出萃取頭立即插入 210℃氣相進樣口，脫吸附5 min, 進行GC/MS分析。

固相萃取纖維預先在250℃下活化30 min以上，頂空瓶放置于30℃恒溫水浴電磁攪拌機中，磁力攪拌下，用SPME裝置的針頭刺穿瓶蓋內(nèi)聚四氟乙烯密封墊，推出萃取頭暴露于頂空中，固定深度3 cm，萃取30 min，停止攪拌，25℃室溫下再平衡吸附15 min，隨即拔出進行GC-MS分析。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

GC條件：采用不分流進樣模式，進樣口溫度210℃，載氣為高純氦氣，柱流速1.99 mL/min，柱前壓83.5 kPa，柱起始溫度35℃，保持3.5 min，以3℃/min升至40℃，保持1 min，再以5℃/min，升至100℃后以10℃/min升至210℃，保持25 min。

MS條件：用電子轟擊(electron impact, EI)源分析,電子能量為70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度210℃，選取全程離子碎片掃描(SCAN)模式，質(zhì)量掃描范圍為45～1000，溶劑延遲0.6 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)根據(jù)GC-MS總離子流圖中各組分的離子碎片質(zhì)量圖譜，通過對NIST庫和WILEY庫檢索結合有關文獻[10,11]進行化合物定性，用面積歸一法計算出各揮發(fā)性成分的百分含量。對5個平行組的樣品建立一個包含樣品種類名稱、每一樣品的峰數(shù)量(基于保留時間和對應質(zhì)荷比)和歸一化后的峰面積數(shù)據(jù)庫，并將此數(shù)據(jù)庫導入SIMCA-P+11.5軟件(瑞典Umetrics AB公司)進行主成分分析(PCA)。

2 結果與討論

2.1 不同種類硅藻間揮發(fā)性成分的差異

從硅藻藻粉樣品GC-MS總離子流圖可見(以骨條藻NMBguh004-2為例，圖1)，本方法能得到樣品豐富的揮發(fā)性成分信息。從角毛藻、冠盤藻、小硅藻、骨條藻NMBguh004-1、骨條藻NMBguh004-2、骨條藻NMBguh004-3、威氏海鏈藻、擬微型海鏈藻和三角褐指藻分別分離出96、83、88、90、101、92、81及76個有效色譜峰，共鑒定出152種揮發(fā)性成分，9種硅藻分別鑒定出76、55、65、58、58、68、62、56和53種物質(zhì)，占有效峰面積的82.14%、84.45%、81.23%、88.36%、85.76%、81.38%、80.23%、83.21%及86.56%，各組分相對百分含量見表1(表中數(shù)值為各樣品5個平行組已鑒定成分的平均值)。對不同硅藻不同平行組進行峰面積積分，把樣品信息和對應揮發(fā)性物質(zhì)的定性定量信息輸入SIMCA-P軟件進行PCA分析，可得到各樣品在第一主成分和第二主成分構成的平面上的投影得分圖(圖2) ，每一標注點代表每一種硅藻的一個樣品。這種在二維空間上顯示物質(zhì)聚類分布的PCA得分圖可以直觀地表征樣品間的相似或非相似性[12]。由圖2可以清楚的看到：小硅藻、威氏海鏈藻、骨條藻NMBguh004-1和冠盤藻4種藻揮發(fā)性組成比較接近，擬微型海鏈藻、骨條藻NMBguh004-2和骨條藻NMBguh004-3揮發(fā)性組成比較接近，而三角褐指藻和角毛藻分別跟其它硅藻有較大的距離，說明與其它硅藻的揮發(fā)性組分差別較大。

圖1 骨條藻(Skeletonema costatum,NMBguh004-2)揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS總離子流圖

1—三角褐指藻； 2—小硅藻； 3—角毛藻； 4—擬微型海鏈藻； 5—骨條藻NMBguh004-3； 6—威氏海鏈藻； 7—骨條藻NMBguh004-1； 8—骨條藻NMBguh004-2； 9—冠盤藻。

圖2硅藻樣品揮發(fā)性成分的PCA得分圖

Fig 2 PCA score plot of marine diatom for the analysis of volatile components

通過PCA對應的載荷圖(圖3)，可以直觀每一個物質(zhì)對于硅藻間差異分類的貢獻，在載荷圖中間的物質(zhì)都是共有的物質(zhì)，而越靠近外緣的物質(zhì)，離哪個樣品近就說明該樣品中對應的物質(zhì)含量會相對較高。依據(jù)協(xié)方差大小，選取了對這9株硅藻揮發(fā)性物質(zhì)差異貢獻度前20種物質(zhì)(表1)，包括10種醛類，2種酮類，3種醇類，2種烷烴類,1種苯酚類物質(zhì)和2種未鑒定出的標志物。

(圖上標注物質(zhì)及數(shù)值為表1中對應揮發(fā)性物質(zhì)及其保留時間)

2.1.1 醛類

在對硅藻的醛類物質(zhì)研究中，小硅藻、三角褐指藻、角毛藻、骨條藻NMBguh004-1、骨條藻NMBguh004-2、骨條藻NMBguh004-3、威氏海鏈藻、擬微型海鏈藻和冠盤藻中醛類所占百分比分別為：21.66%、33.78%、27.5%、31.2%、39.55%、33.03%、32.33%、47.24%和43.2%，鑒定出的醛類物質(zhì)分別有12種、13種、19種、12種、17種、19種、12種、19種及18種。在這些物質(zhì)中，2-丁烯醛、庚醛、2,4-庚二烯醛、壬醛、2-壬烯醛在9種硅藻中都被鑒定出，從鑒定結果(表2)可知：在平臺后期硅藻的揮發(fā)性醛類物質(zhì)中壬醛占了絕對的優(yōu)勢，而從PCA得分圖及其對應載荷圖可見，壬醛是造成三角褐指藻和角毛藻明顯分別于其它硅藻的最主要揮發(fā)性成分，其在三角褐指藻中相對百分含量高達13.8%，而在角毛藻僅為4.48%(表2)。壬醛通常產(chǎn)生辛辣的刺激性氣味[13], 因其在9種硅藻中相對百分含量較高，它可能對硅藻的特征風味有重要貢獻。2-戊烯醛、庚醛、2,4-庚二烯醛、2,4-辛二烯醛是造成擬微型海鏈藻、骨條藻NMBguh004-2、骨條藻NMBguh004-3區(qū)別于其它硅藻的重要揮發(fā)性組分，其中2-戊烯醛在骨條藻NMBguh004-2中相對百分含量最高達到5.55%，擬微型海鏈藻中庚醛百分含量最高達到5.71%，骨條藻NMBguh004-2 中2,4-庚二烯醛含量達到3.57%，2,4-辛二烯醛在2種骨條藻中的相對百分含量明顯高于其它幾種硅藻，分別達到5.31%和4.78%。

有文獻指出，不飽和醛類物質(zhì)對撓足類的繁殖失敗有關系[14]。從以上分析可知：此時期的骨條藻NMBguh004-2、骨條藻NMBguh004-3、擬微型海鏈藻因含較高的不飽和醛類物質(zhì)而與其它硅藻明顯分類，因此處于平臺后期的這3種硅藻可能并不適合作為橈足類的餌料藻。而小硅藻、角毛藻、三角褐指藻、骨條藻NMBguh004-1因不飽和醛類物質(zhì)相對含量較其它藻要低，相對其它幾類藻可能比較適合橈足類的飼養(yǎng)。

表1 決定9株硅藻樣品差異的前20種揮發(fā)性成分

低級飽和脂肪醛一般具有強烈的刺鼻氣味，隨著鏈長的增加其刺激性氣味逐漸減弱[14]，但不飽和醛大多有愉快的香氣[15]，如2-己烯醛呈現(xiàn)青草氣味[16]，而2,4-庚二烯醛被認為具有魚腥味和金屬味[17]。在生物體內(nèi)，很多醛類物質(zhì)都來源自脂肪酸，在硅藻中作為重要生物標志物的2,4-辛二烯醛已在很多魚肉中被檢出且與魚腥味的產(chǎn)生有著密切的關系[18]。有文獻指出[19]2,4-辛二烯醛的產(chǎn)生量與十六碳三烯酸含量有很大的相關性，所以這種小分子醛類的變化也可以在一定程度上反應出硅藻間十六碳三烯酸含量的變化。在小硅藻、威氏海鏈藻、三角褐指藻中還檢測到苯甲醛，它被認為是烤花生中的主要羰基化合物，具有令人愉快的香味，在針對大眼金槍魚肉的風味研究認為對整體風味具有加和作用[20]?？梢?，這些醛類物質(zhì)的混合構成了對應微藻各自具備特征氣味，它們對魚蝦貝蟹的肉質(zhì)風味形成和對餌料藻的攝食選擇可能也起著很重要的作用。

2.1.2 烷烯烴類

除醛類物質(zhì)外，硅藻中另外一大類揮發(fā)性物質(zhì)為烷烯烴類，總共鑒定出44種，相對含量在小硅藻、三角褐指藻、角毛藻、骨條藻NMBguh004-1、骨條藻NMBguh004-2、骨條藻NMBguh004-3、威氏海鏈藻、擬微型海鏈藻、冠盤藻在已鑒定出的組分中烷烯烴類所占百分比分別為32.38%、14.23%、38.38%、26.83%、13.19%、26.19%、20.06%、26.83%和25.24%。角毛藻中的烷烯烴類物質(zhì)的百分含量明顯高于其它硅藻，由PCA得分圖(圖2)及載荷圖(圖3)可知：8-十七碳烯是造成角毛藻與其它硅藻不同的主要原因。由表2可見，這幾類硅藻中只在角毛藻中檢測到8-十七碳烯，相對百分含量高達5.83%。在這類物質(zhì)中，小硅藻的烷烯烴類物質(zhì)的總含量明顯高于其它幾類硅藻，其中己烷、十五烷、1-十五烯、十六烷含量明顯高于其它烷烯烴物質(zhì)含量。烷烯烴類主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂，這些飽和或不飽和脂肪酸感覺閾值[21]較醛類高，一般對香氣影響不大。有些烷烯烴類在一定條件下裂解之后是產(chǎn)生腥味的潛在物質(zhì)[22]。

2.1.3 酮類

共有21種酮類物質(zhì)中被鑒定出，冠盤藻中酮類物質(zhì)相對百分含量最高(19.21%)。3,5-辛二烯-2-酮在這些藻中都被檢測到，其中擬微型海鏈藻中百分含量相對最高(3.32%)，骨條藻NMBguh004-1中含量相對較低(0.48%)。

1-戊烯-3-酮是硅藻中被檢出的一種主要的生物標志物，這幾類硅藻中1-戊烯-3-酮百分含量最高的為冠盤藻(6.63%)，小硅藻相對較低(0.86%)，在角毛藻和三角褐指藻中未被檢測到。由于低級不飽和酮通常是具有刺激性氣味[23]，所以這種酮類物質(zhì)可能會對硅藻的風味帶來不良的影響。此外，3,5-辛二烯-2-酮在9種硅藻中都有檢出，這種物質(zhì)對魚腥味有加強的作用[24]。

2.1.4 醇類

9種硅藻中，總共鑒定出24種醇類物質(zhì)，醇類物質(zhì)總含量相對最高的是角毛藻(17.45%)，擬微型海鏈藻最低(6.55%)，其中，1-戊烯-3-醇是9種硅藻中普遍存在的醇類物質(zhì)，含量最高的是NMBguh004-3(4.24%)，小硅藻中最低(1.25%)。從表2可知，1-己烯-3-醇和1-己炔-3-醇是硅藻揮發(fā)性成分分類的重要標志物，這兩類物質(zhì)對于威氏海鏈藻、骨條藻NMBguh004-2、骨條藻NMBguh004-3的分類起著重要作用(圖2，圖3)，它們在骨條藻NMBguh004-2中百分含量最高(分別為3.73%和4.44%)。

總體而言，揮發(fā)性醇會形成品質(zhì)較為柔和的氣味[17]，在這些微藻中均檢測到1-己烯基-3-醇，該醇的氣味主要為青草味。1-辛烯-3-醇具有蘑菇風味特征[25]，已經(jīng)在多種淡水魚和海藻中被發(fā)現(xiàn)[22]，這種醇在角毛藻和三角褐指藻中被檢測到。在9種硅藻中，角毛藻醇類物質(zhì)含量最高且種類最多，醇類物質(zhì)因氣味柔和對角毛藻的整體風味有著有益影響，可能會促進貝類等攝食者對其的攝食選擇。

2.1.5 其它物質(zhì)

三角褐指藻中苯酚類和呋喃類物質(zhì)的相對百分含量都明顯高于其它硅藻，其中，2,6-二甲基苯酚的相對百分含量高達11.59%，這類物質(zhì)大多具有特殊的芳香氣味, 2,6-二甲基-苯酚也是三角褐指藻區(qū)別于其它硅藻的主要生物標志物(表1)，由于它在其它硅藻中含量很低，所以對另外8種硅藻的風味影響不大。在骨條藻NMBguh004-3中2-乙基呋喃的相對百分含量達到2.22%，呋喃類化合物大都具有很強的肉香味，2-乙基呋喃具有強烈的焦香氣味[26]。羧酸類在硅藻中檢出種類和含量都很少，僅在威氏海鏈藻、小硅藻、冠盤藻中檢測到少量壬酸，三角褐指藻中檢測到癸酸。在這些酸類物質(zhì)中，相對百分含量最高的即為三角褐指藻中的癸酸為2.35%。

此外，在這些硅藻中都檢出了一種噻唑類物質(zhì)和一些含氯化合物，這些物質(zhì)含量雖低但在這幾種硅藻中普遍存在。對于硅藻中檢測出這類含量不高但普遍存在的噻唑類物質(zhì)，其氣味極強，廣泛存在于多種食品之中，多具有鮮菜、烤肉或堅果的香氣[27]，此物質(zhì)的存在可能對硅藻的整體風味有著一定的影響。已有研究指出，海藻是揮發(fā)性鹵素化合物的重要資源，多種紅藻中都存在鹵化物[38]，而在本次實驗中，在9種硅藻中均檢測到一些揮發(fā)性鹵化物，說明硅藻也是揮發(fā)性鹵化物的重要資源。另外，在一些硅藻中，檢測到乙基苯和對二甲苯，這類物質(zhì)對硅藻的整體風味有著不利的影響[29]。值得我們注意的是，二甲基硫這種含硫化合物在9種硅藻樣品中都被鑒定出，這幾類硅藻中骨條藻(NMBguh004-1)二甲基硫含量最高，其相對含量達到9.16%，其次是小硅藻達到6.7%，在角毛藻、威氏海鏈藻、擬微型海鏈藻、骨條藻NMBguh004-2二甲基硫含量很低，相對含量都低于2%。在低濃度時，DMS會產(chǎn)生一種令人愉快的類蟹香，在較高濃度時卻呈一種異常的氣味，所以二甲基硫的含量決定了其對整體風味是有利還是有害[30]。有研究指出，二甲基硫是海洋中最豐富的揮發(fā)性硫化物[31]，可以通過海氣交換進入大氣，從而影響局部甚至整個海域的氣候以及形成酸雨、酸霧等[32]。從以上硅藻揮發(fā)性成分數(shù)據(jù)結果可知，骨條藻(NMBguh004-1)和小硅藻中二甲基硫相對于其它硅藻來說，對其周圍水環(huán)境甚至大氣環(huán)境影響相對較大。

表2 9種海洋硅藻后期揮發(fā)性成分鑒定結果

續(xù)表2 (Table 2 Continued)化合物名稱分子式1234567893-甲基-戊醛 C6H12O----1.873.563.071.594.743-甲基-戊醛C6H12O---1.92-----2-己烯醛C6H10O1.490.891.49 3.621.772.171.255.961.622,4-戊二烯醛C5H6O3.561.792.10 ------2,6-己二烯醛 C6H8O---0.880.22--0.44-庚醛C7H14O3.11.431.53 3.982.451.343.152.375.714-庚烯醛C7H12O0.56-0.42 1.780.530.77--0.432-庚烯醛C7H12O-------0.951.392,4-庚二烯醛C7H10O2.521.922.38 3.173.762.431.513.574.12辛醛C8H16O3.561.23--3.84----2-辛烯醛C8H14O--2.30 2.5721.60.92-2.352,4-辛二烯醛C8H12O--2.09 5.310.672.26-4.78-壬醛C9H18O13.88.015.48 4.936.689.017.95.966.862-壬烯醛C9H16O0.781.340.72 2.540.930.892.320.621.62,6-壬二烯醛C9H14O---1.35-----癸醛C10H12O-0.86 0.761.151.231.040.67E-2-癸烯醛C10H18O--0.27 1.560.7---0.332,4-癸二烯醛C10H16O -------0.710.26正十一醛C11H22O1.12--------2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-甲醛C10H16O 0.152.311.05 0.751.20.461.062.920.65苯甲醛C7H6O2.471.173.7------己烷C6H140.967.650.48 0.89-8.870.830.274.57環(huán)己烷C6H12----0.220.38---2,4,4-三甲基-2-戊烯C8H16---1.95---0.18-2-甲基-2,3-己二烯 C7H12----0.26----2,3-二甲基-1-戊烯C7H14--0.02 1.850.4--0.56-2,6-辛二烯C8H16----1.14----1,3,5-辛三烯 C8H12-----0.88---3,5,5-三甲基-2-己烯C9H183.891.541.19 0.882.40.841.54-1.417-甲基-3,4-辛二烯 C9H161.12-------0.62-壬炔C9H162.45-0.62 0.88-0.84-0.51.572,4-壬二烯C9H16-------3.563.072,3,6-三甲基-1,6-庚二烯C10H18--1.11 --0.79---2,3,6-三甲基-1,6-庚二烯 C10H18--------1.868-甲基-癸烷C11H22-0.89-------十二烷 C12H26-0.37-------正十三烷C13H280.7-0.51 ------3,8-二甲基癸烷C12H26--0.65 ------正十四烷C14H30-1.915.04 2.334.571.783.141.03十四碳烯C14H281.31--------2-甲基癸烷C11H24--0.46 --0.47---壬基環(huán)戊烷 C14H28------0.43--癸基環(huán)戊烷C15H30-1.8--2.01----2-甲基正十四烷C15H32-0.50.45 ----1.99-2,6,10-三甲基十二烷C15H32-0.13--1.23-1.15-0.26正十五烷C15H32-2.516.10 1.781.961.343.581.20.931-十五烯C15H321.713.5-------3-甲基十四烷C15H32--1.35 ----1.4-3-甲基-十五烷 C16H34----3.05---0.672-甲基十五烷C16H34-2.462.84 -0.670.741.851.950.74十一烷基環(huán)戊烷C16H32 ------1.740.49-正十六烷C16H341.695.855.53 2.555.243.946.98-3.882,6,10-三甲基-十五烷C18H38--1.55 -----1.924-甲基十六烷C17H36-0.560.38 ------2-甲基十六烷C17H36-0.950.56 -----0.64

“-”表示在樣品中未檢測到該物質(zhì)。

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