蛇毒類激肽釋放酶的研究進展

周 茜，許文濤,2，黃昆侖,2，羅云波,2，馬 骉

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083; 2. 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100083; 3. 北京賽升藥業(yè)股份有限公司，北京 100176)

蛇毒是由毒蛇毒腺分泌的一類天然毒液，含有多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其它小分子物質(zhì)，具有廣泛地生物學(xué)活性，常作為天然藥用資源庫進行研究[1]。隨著藥理學(xué)、毒理學(xué)和藥物學(xué)的發(fā)展，蛇毒酶類在抗血栓、止血、鎮(zhèn)痛、降壓及抗腫瘤方面表現(xiàn)出很大的潛力[2-4]。根據(jù)酶活力中心特點，蛇毒酶類分為絲氨酸蛋白酶類和金屬蛋白酶類；根據(jù)活性功能分為蛋白水解類、抗凝血類、促凝血類和激肽釋放類[5]。其中蛇毒類激肽釋放酶，是與激肽釋放酶性質(zhì)相似的一類絲氨酸蛋白酶的總稱，能作用激肽原生成激肽，具有擴張血管，改善微循環(huán)和調(diào)節(jié)血壓等作用；同時還可以作為活化因子，激活纖溶酶原，提高纖溶系統(tǒng)和膠原水解酶活性，起到防止血凝，抗血栓形成，該酶對開發(fā)為心腦血管疾病治療藥物具有重要的應(yīng)用前景[6，7]。目前對蛇毒類激肽釋放酶的綜述報道尚屬空白，本文就其分布、分離制備、生化性質(zhì)、藥效研究以及此領(lǐng)域的研究進展等做一詳細綜述，為今后蛇毒類激肽釋放酶的研究提供參考依據(jù)。

1 蛇毒類激肽釋放酶的分布

1948年，Rocha等[8]首次在矛頭腹Bothropsjararaca蛇毒中發(fā)現(xiàn)了類激肽釋放酶，與血液共同孵育時表現(xiàn)為一種平滑肌舒張物質(zhì)，而將其注入動物體內(nèi)會引起血壓的下降，此后激肽釋放酶廣泛在哺乳動物的血漿和胰臟等腺體組織中發(fā)現(xiàn)。迄今為止，研究人員已經(jīng)在響尾蛇屬、腹亞科、蝰亞科和眼鏡蛇科等種屬的30余種毒蛇蛇毒中都分離得到了類激肽釋放酶。Oshima等[9]根據(jù)精氨酸酯酶及類激肽釋放酶的活性，指出類激肽釋放酶在腹亞科蛇毒中的活力最高。Abdusalam等[10]研究了響尾蛇屬、蝰亞科、眼鏡蛇科等15種毒蛇蛇毒的激肽酶、酪氨酸酯酶、精氨酸酯酶及激肽釋放酶的活性，指出所有響尾蛇屬和蝰亞科蛇毒中都含有類激肽釋放酶的分布，而在蝮亞科Agkistrodonhalysussuriensis中活性較高，與前人研究結(jié)果一致。

2 蛇毒類激肽釋放酶的分離純化及制備

傳統(tǒng)的蛇毒酶類主要采用色譜法進行分離純化，類激肽釋放酶也是如此，包括離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法，并結(jié)合親和層析輔助純化完成[11, 12]。常用的陰離子交換劑有DEAE-葡聚糖凝膠和DEAE-纖維素等，葡聚糖凝膠有SephadexG-100和SephadexG-75用作分離。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)對蛇毒酶類進行重組表達的技術(shù)越來越成熟。目前已有多種蛇毒酶類獲得了具有活性的重組表達產(chǎn)物，如來自南美洲矛頭蛇毒中的降纖酶和止血酶Batroxobin，菜花烙鐵頭蛇毒中的纖溶酶Jerdonitin和綠蝮蛇毒中的抗血小板凝集的金屬酶Albocollagenase等[13-15]。

相應(yīng)的，蛇毒類激肽釋放酶的重組表達也有相關(guān)研究。Huang等[16]將烙鐵頭蛇毒激肽釋放酶基因與兩個限制性內(nèi)切酶切位點BamH I、PstI和組氨酸標簽基因構(gòu)建克隆到載體pQE30后，轉(zhuǎn)入E.coliM15中進行原核表達，表達產(chǎn)物經(jīng)免疫雜交、液相色譜分析、電噴霧質(zhì)譜和N端氨基酸分析驗證，結(jié)果表明重組表達類激肽釋放酶Tm-5與天然烙鐵頭蛇毒激肽釋放酶結(jié)構(gòu)一致，且對天然Tm5的底物N-benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilide具有很高的活性，表明重組類激肽釋放酶Tm表達成功。Wang等[17]首次報道了將江浙蝮蛇蛇毒類激肽釋放酶基因克隆到pCS2+表達載體后，轉(zhuǎn)入小麥麥胚無細胞表達系統(tǒng)進行表達，通過對載體、RNA聚合酶濃度、磷酸肌酸和Cu2+等條件的優(yōu)化，表達的重組表達激肽釋放酶活性為1.3 U/mg，能達到天然蛇毒激肽釋放酶活性(1.74 U/mg)的75%，得到了具有相對高活性的無細胞表達的類激肽釋放酶，為無細胞表達載體的應(yīng)用前景提供了依據(jù)。

3 蛇毒類激肽釋放酶的生化性質(zhì)研究

哺乳動物體內(nèi)有兩種激肽釋放酶：組織型激肽釋放酶和血漿型激肽釋放酶。組織型激肽釋放酶作用于高分子量激肽原和低分子量激肽原，均釋放胰激肽，血漿型激肽釋放酶只作用高分子量激肽原釋放緩激肽。大部分來自腹亞科和響尾科蛇毒的激肽釋放酶與血漿型激肽釋放酶特異性一致，只作用于高分子量激肽原釋放緩激肽，然而來自原矛頭蝮屬毒蛇蛇毒的elegaxobinⅡ與組織型激肽釋放酶特異性一致，能夠分別作用于高分子量和低分子量激肽釋放胰激肽[18]。激肽釋放酶在哺乳動物體內(nèi)都是酶原形式存在的，要經(jīng)蛋白酶作用后剪切，去掉氨基端的6個氨基酸殘基形成活性形式后才能發(fā)揮生物活性，而蛇毒類激肽釋放酶與其不同，不需要激活，直接可以用于激肽原釋放激肽，引起下游的生物學(xué)反應(yīng)[19]。

目前發(fā)現(xiàn)的類激肽釋放酶均屬于單體糖蛋白，分子量約為30～35 kD。糖鏈結(jié)構(gòu)主要有海藻糖、己糖和唾液酸等，其所占蛋白分子量的比例均有不同，來自Agkistrodoncaliginosus類激肽釋放酶的糖鏈比重為10.1%[20]，而來自AgkistrodonhalysPallas的糖鏈為23.3%[21]。目前糖鏈結(jié)構(gòu)對類激肽釋放酶作用機制的影響不是很明確，可能會對蛋白結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用[22]，而在某些酶如LV-Ka中，通過糖苷酶F去除所有糖鏈時，其失去了90%酰胺酶的活性，表明糖鏈結(jié)構(gòu)直接參與了底物分子的識別[11]，但是對其精確的糖鏈結(jié)構(gòu)及相關(guān)作用機制尚未有報道。

許多蛇毒類激肽釋放酶同時具有兩種或兩種以上的酶活力，如來自響尾蛇屬的Taiwanhabu蛇毒中的纖溶酶同時具有激肽釋放酶活性[23]，蝰亞科的Bothropsjararacussu蛇毒中的BjussuSP-I同時具有凝血酶、促凝血酶和激肽釋放酶3種活性[24]，自Crotalsmantes的crotalase，竹葉青屬Trimeresuruselegans蛇毒中的elegaxobin II都同時具有凝血酶和類激肽釋放酶活性[20]，而LV-Ka除對S-2302和S-2266具有特異性，研究也發(fā)現(xiàn)當將其與纖溶酶原孵育時會對底物Tos-Gly-Pro-Lys-pNA水解，說明其兼有激活纖溶酶原活性，而對凝血酶底物S-2238和纖溶酶底物Tos-Gly-Pro-Lys-pNA不具有酶解活性[25]。蛇毒類激肽釋放酶對激肽釋放酶底物S-2302和S-2266均具有較高的特異性和酶活性，同時對甲苯磺酰精氨酸甲酯(TAME)和苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE)也具有水解活性，并可被二異丙基氟磷酯(DFP)和苯甲基磺酰氯(PMSF)所抑制，也顯示其作為一種絲氨酸蛋白酶的本質(zhì)。

4 蛇毒類激肽釋放酶的結(jié)構(gòu)研究

迄今為止，科學(xué)家研究報道了近10種蛇毒類激肽釋放酶的全部或部分氨基酸序列，包括來自蝮蛇Agkistrodoncaliginosus蛇毒的KR-E-1，江浙蝮蛇Agkistrodonhalyspallas蛇毒的AHP-Ka，矛頭蝮蛇Bothropsjararaca蛇毒的BjussuSP-I，花蝮蛇Agkistrodonhalysblomhoffii蛇毒的Halystase，以及來自響尾蛇屬Prairierattlesnake蛇毒和蝰亞科Aspicviper蛇毒中的類激肽釋放酶[12,21,24, 26-28]，相對于蛇毒中的類凝血酶、類纖溶酶和神經(jīng)毒素等活性蛋白的報道，類激肽釋放酶的研究相對薄弱一些。Matsui等[26]首次報道了從花腹蛇毒中分離得到的類激肽釋放酶(Halystase)的完整氨基酸序列，其與激肽釋放酶的同源性為42%，與凝血酶為26%，與蛇毒類凝血酶為66%～72%，并表現(xiàn)出一些溶血纖蛋白原的活性，優(yōu)先作用于血纖蛋白原B鏈的Arg4位，并能緩慢降解A鏈，但不生成血纖肽A或B，不能形成正常的血凝塊，因此Halystase誘導(dǎo)了降低血壓和阻礙血液凝固兩個作用。Sant,Ana等[24]對Bothropsjararaca蛇毒的BjussuSP-I的分子特性進行分析，表明BjussuSP-I具有其它蛇毒絲氨酸蛋白酶家族的保守序列，并有利證明了酶分子的糖鏈對于其活性發(fā)揮重要作用，而且會成為蛇毒來源酶類物質(zhì)生物活性優(yōu)化的最重要特性。Oyama等[27]對Agkistrodoncaliginosus蛇毒的KR-E-1的氨基酸序列進行詳細分析，結(jié)果表明其包含235個氨基酸，具有絲氨酸蛋白酶家族的保守序列(His57, Asp102, and Ser195)，在36號氨基酸位置具有N連接糖基化位點。KR-E-1的氨基酸序列與組織激肽釋放酶，牛凝血酶β鏈，KN-BJ 2, elegaxobin和elegaxobin II的同源性分別達到了32%、31%、65%、65%和67%。1～50號氨基酸都屬于疏水性氨基酸，73～101號氨基酸包含許多賴氨酸殘基，而此特征是此酶與其它蛇毒絲氨酸蛋白酶和人類激肽釋放酶的不同之處。在其一級結(jié)構(gòu)序列中，酶活力中心Ser195之前有6個天冬氨酸殘基，這種保守序列也同樣出現(xiàn)在以上5種酶的一級結(jié)構(gòu)序列中，這都表明它們都具有胰蛋白酶家族的特異性。

研究人員對蝰亞科和腹亞科蛇毒絲氨酸蛋白酶研究發(fā)現(xiàn)：1)具有高度的序列相似性，其催化中心的3個氨基酸殘基His57, Asp102和Ser195有一致的幾何學(xué)定位；2)一級序列同源性高，N末端通常為V-X-G-G-D-E-C-N-I-N-E-H；3)分子中都存在12個半胱氨酸形成的6個二硫鍵，分別位于Cys22-Cys157，Cys42-Cys58，Cys92-Cys245，Cys136-Cys201，Cys168-Cys182，Cys192-Cys157；4)活性中心外第59～68，93～101，169～180號氨基酸是3個高度變異的可變區(qū)，但這些區(qū)域的功能尚不明確，但該差異造成了類激肽釋放酶、類凝血酶和類纖溶酶等蛇毒酶底物專一性的差異，進一步體現(xiàn)為生物學(xué)和藥理學(xué)功能的差異[29]。

5 蛇毒類激肽釋放酶的藥理藥代研究

相對于已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療凝血和血栓性疾病的蛇毒酶類藥物如類凝血酶和類纖溶酶，蛇毒類激肽釋放酶的藥理藥代研究相對薄弱，主要集中在促進細胞增殖和改善血液微循環(huán)等研究方面[5]。楊壯來[30]采用白眉蝮蛇毒激肽原酶研究對腦缺血再灌注大鼠模型進行研究，結(jié)果表明蛇毒激肽原酶能明顯增加腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)血管上皮細胞的表達，促進血管的增生，從而對缺血區(qū)的神經(jīng)再生和神經(jīng)保護發(fā)揮重要的作用。伊力哈木江-依馬木等[31]采用白眉蝮蛇毒激肽原酶研究對糖尿病大鼠模型的血液學(xué)變化，結(jié)果顯示蛇毒激肽原酶能明顯降低糖尿病大鼠的全血黏度以及血小板的聚集率，表明蛇毒激肽原酶具有減少紅細胞聚集，降低血液黏滯度，改善血瘀癥狀和紅細胞變形能力，改善血管病變，而達到防治糖尿病血管病變的作用。Zhou等[32]利用雙抗夾心ELISA方法對Agkistrodonhalyspallas蛇毒中的AHP-Ka在SD大鼠中的藥代動力學(xué)進行研究，結(jié)果表明其在SD大鼠血漿中的半衰期約為56 min，代謝趨勢符合一室開放模型，揭示了AHP-Ka在SD大鼠血漿中的藥代動力學(xué)特點和代謝趨勢，為后期AHP-Ka進行臨床前藥代動力學(xué)研究提供了理論參考。而近年來，人組織激肽釋放酶的藥效研究主要集中在腦缺血及腦缺血再灌注、腦梗塞、心肌缺血再灌注等病癥中的促進血管再生和減少神經(jīng)細胞死亡等方面[33，34]，這為將來蛇毒類激肽釋放酶重點集中于研究促進血管再生、神經(jīng)細胞發(fā)生以及改善微循環(huán)等藥理藥效的研究方向提供了參考依據(jù)，為進一步研究其藥理藥效作用奠定了基礎(chǔ)。

6 蛇毒類激肽釋放酶研究的展望

蛇毒是一類天然的藥用資源庫，含有多種特異性的活性多肽和蛋白類物質(zhì)。目前臨床上有很多藥物都是根據(jù)蛇毒活性成分的作用機制來進行設(shè)計和應(yīng)用的，如Cushman和Ondetti[35]報道的降壓藥物卡托普利，根據(jù)巴西箭頭毒蛇Bothropsjararaca蛇毒中一種活性多肽的降壓機制而研制；抗凝血劑Integrilin[36]，根據(jù)美國東南響尾蛇Sistrurusmiliarusbarbouri蛇毒的一種活性酶而研制，目前都已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療上。還有一些正在進行臨床研究的候選藥物，如澳大利亞昆士蘭大學(xué)的研究人員正在對來自Australian elapid venoms蛇毒中的3個針對心腦血管疾病的候選藥物：Textilinin-1，Haempatch和CoVase重點進行臨床前應(yīng)用研究，開發(fā)成功后將會為心腦血管疾病領(lǐng)域的治療增加一類新藥[37]。由此可見，蛇毒中的活性成分都極其具有開發(fā)為臨床治療藥物的潛能，為相關(guān)疾病的治療帶來新的希望。而目前關(guān)于蛇毒類激肽釋放酶的研究主要集中在酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定等方面，對藥理、藥效和藥代性質(zhì)的研究相對比較薄弱，這為蛇毒類激肽釋放酶開發(fā)為新藥提供了巨大的潛力和發(fā)展空間，為治療心腦血管疾病帶來新的治療前景。

常規(guī)的分離純化技術(shù)得到的蛇毒酶類純度不高，且蛇毒酶類的性能會受到地域、氣候、毒蛇養(yǎng)殖條件和不同批次蛇毒分離純化條件的影響，使得酶制劑的性能不均一而影響蛇毒酶類深入的研究和發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將研究手段從蛋白質(zhì)水平轉(zhuǎn)向分子水平，通過克隆蛇毒酶類基因，轉(zhuǎn)入表達載體進行表達，而隨著對改進表達系統(tǒng)，產(chǎn)物蛋白復(fù)性、后修飾及對宿主毒性，提高表達量和生物活性等研究方面的深入，都使得利用基因工程手段表達制備具有活性的重組蛇毒酶類成為未來的研究方向，也是制備蛇毒類激肽釋放酶的研究方向，這會使天然蛇毒資源和產(chǎn)品純度的問題得到解決，為更深入地研究其藥理藥效作用機制提供豐富的物質(zhì)來源。

隨著分子生物學(xué)和基因工程等生物技術(shù)的飛速發(fā)展，相信蛇毒類激肽釋放酶的研究會越來越深入，更能廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究并在臨床醫(yī)學(xué)上發(fā)揮重要治療作用。

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