葡萄糖氧化酶解除黃曲霉毒素B1應(yīng)用研究

胡常英，王云鵬，范 星，秦慧娟

(1. 河北省微生物研究所，保定 071051； 2. 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024； 3. 石家莊理工職業(yè)學(xué)院，石家莊 050228)

黃曲霉毒素是一類由真菌產(chǎn)生的能引起人和動(dòng)物疾病的劇毒物質(zhì)。它普遍存在于糧食、油料作物的種子、水果、蔬菜中，甚至在乳制品、肉類、海鮮類的加工產(chǎn)品中也發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素。黃曲霉毒素對(duì)人和動(dòng)物都表現(xiàn)了很強(qiáng)的急性毒癥反應(yīng)，具體表現(xiàn)為發(fā)燒、嘔吐、腹瀉、厭食、腸胃功能紊亂等現(xiàn)象[1，2]。自20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素中毒癥以來，相繼又發(fā)現(xiàn)了100多種真菌毒素，經(jīng)試驗(yàn)證明，尤以黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)。據(jù)資料調(diào)查顯示，世界上每年有數(shù)千萬只家畜、家禽因黃曲霉毒素中毒死亡。這已引起世界各國的高度重視。

黃曲霉毒素的解毒方法很多，可分為物理、化學(xué)和微生物法等幾種[3]。物理法主要采用活性炭及礦物質(zhì)等吸附材料吸附毒素，此法會(huì)受到材料吸附能力的限制；化學(xué)法以有機(jī)溶劑沉淀為主，在去除毒素的同時(shí)，其糧食或飼料的營養(yǎng)成分有所損失；微生物降解法是目前解毒研究推廣的重點(diǎn)方法之一[4-6]。微生物降解法的精華是微生物代謝產(chǎn)物——微生物酶[7]。酶可破壞黃曲霉毒素的分子結(jié)構(gòu)，使之失去毒性作用。因此，微生物酶被公認(rèn)為是理想的解毒劑之一。葡萄糖氧化酶是一種飼料添加劑，它是一種需氧脫氫酶[8]，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸中菌群平衡的功效。經(jīng)大量的應(yīng)用試驗(yàn)證實(shí)，該酶具有抑制黃曲霉菌生長和降解黃曲霉毒素的作用。尤其用于小雞飼料防霉和解毒劑，效果更佳。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)選用“京粉”品種的1日齡小雞2000只為試驗(yàn)對(duì)象，分別以固體和液體兩種葡萄糖氧化酶(河北省微生物研究所產(chǎn))為解毒酶制劑，固體酶中葡萄糖氧化酶含量25 U/g和液體酶中為25 U/mL，以含500 ppb和2000 ppb黃曲霉毒素B1(Sigma公司產(chǎn))的玉米飼料為有毒源進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：河北保定。

1.2 試驗(yàn)方法

將2000只小雞分為兩大組，分別為固體酶試驗(yàn)和液體酶試驗(yàn)。每大組1000只小雞均分為5組，每組200只。分別為自然對(duì)照組(飼料中不含黃曲霉毒素B1，也不含葡萄糖氧化酶)；500 ppb對(duì)照組，飼料中含500 ppb濃度的黃曲霉毒素B1，不加葡萄糖氧化酶；500 ppb加酶組，飼料中含500 ppb濃度黃曲霉毒素B1，同時(shí)按5‰比例加入葡萄糖氧化酶飼料添加劑； 2000 ppb對(duì)照組，飼料中含2000 ppb濃度黃曲霉毒素B1；2000 ppb加酶組，飼料中含2000 ppb黃曲霉毒素B1和5‰葡萄糖氧化酶飼料添加劑。

固體酶采用與飼料混合方式喂養(yǎng)；液體酶飼料添加劑按5‰(體積比)加入飲用水中，采用飲水方式喂養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)采用間歇喂養(yǎng)方式進(jìn)行，每個(gè)階段連續(xù)喂養(yǎng)15 d和停止7 d為一個(gè)周期。每天觀察小雞體貌特征，活動(dòng)現(xiàn)象，啄食興趣情況等，并連續(xù)記錄35周中小雞死亡數(shù)量。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 表觀現(xiàn)象

小雞出生后對(duì)飼料和飼料添加劑不適應(yīng)，攝食量甚少,一周后增加食欲。從第二周開始，攝食含黃曲霉毒素B1500 ppb和2000 ppb飼料的對(duì)照組均有明顯腹瀉現(xiàn)象，而且，毒素濃度大，腹瀉嚴(yán)重。部分小雞活動(dòng)遲緩，病態(tài)。添加葡萄糖氧化酶組腹瀉較輕。精神狀況好于對(duì)照組。從表觀現(xiàn)象看，在35周的試驗(yàn)過程中，加葡萄糖氧化酶飼料喂養(yǎng)的小雞比不加酶含有毒素的對(duì)照組有精神，有活力，啄食欲望強(qiáng)，雞毛順流、光滑、整齊。整體分析，500 ppb加酶組精神狀況要好于自然對(duì)照組；2000 ppb加酶組與自然對(duì)照組相比較差。

從以上表觀現(xiàn)象分析，葡萄糖氧化酶對(duì)解除黃曲霉毒素B1表現(xiàn)了較好的作用，尤其在500 ppb低濃度下，完全可以解除黃曲霉毒素B1的危害，使機(jī)體的抗病能力好于自然對(duì)照組。添加固體酶解毒現(xiàn)象好于液體酶。

2.2 黃曲霉毒素B1中毒小雞死亡數(shù)量比較

2.2.1 固體酶解毒效果

在飼料中含黃曲霉毒素B1500 ppb和2000 ppb濃度喂養(yǎng)試驗(yàn)中，高濃度和低濃度及加酶組和對(duì)照組中小雞的死亡數(shù)量均有明顯差異，固體酶與液體酶解毒效果也有差距。應(yīng)用固體酶解毒試驗(yàn)，具體記錄數(shù)據(jù)見表1，第35周小雞存活率結(jié)果見表2。

表1 35周內(nèi)固體酶解毒小雞死亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 The death quantity of the chicken after treated with glucose oxidase in 35 weeks

表2 第35周固體酶解毒小雞存活率比較Table 2 The suvival ratio of the chicken after treated with solid glucose oxidase in the 35th week

自然對(duì)照組中，在35周試驗(yàn)中共死亡30只，存活率達(dá)85%。15周左右處于死亡高峰。小雞孵出10周內(nèi)，機(jī)體免疫力主要來源于母體遺傳因素，在10周前后處于轉(zhuǎn)折階段，由母體攜帶到自身產(chǎn)生變化，此階段機(jī)體抗病能力低，傳染性病毒疾病易發(fā)作[9，10]，死亡率較高。

500 ppb對(duì)照組存活率為65.5%，與自然對(duì)照組相比，存活率下降19.5%。加喂葡萄糖氧化酶后，與對(duì)照組相比，存活率提高了21%，比自然對(duì)照組存活率高1.5%。通過以上幾組數(shù)據(jù)比較顯示，葡萄糖氧化酶對(duì)黃曲霉毒素B1有較好的解毒作用。飼料中含黃曲霉毒素B1在500 ppb濃度下，完全可以解除毒性作用。

2000 ppb濃度喂養(yǎng)小雞，由于黃曲霉毒素B1濃度大，毒力強(qiáng)，死亡高峰在第11周出現(xiàn)，比500 ppb組提前5周。加酶組與對(duì)照組相比，存活率提高39.5%。雖然151只低于500 ppb組的173只的存活數(shù)量，但足以顯示葡萄糖氧化酶較強(qiáng)的解毒能力。

由葡萄糖氧化酶酶促反應(yīng)原理分析得出，葡萄糖氧化酶進(jìn)入胃腸后，大大降低氧含量，抑制好氧菌生長，促進(jìn)厭氧菌生長繁殖，有利于飼料分解、吸收，加強(qiáng)了機(jī)體代謝作用，提高了小雞解毒和抗病能力。

2.2.2 液體酶解毒效果

液體酶不便于加入飼料中，而是采用飲水方式喂養(yǎng)。液體酶喂養(yǎng)解毒效果見表3,存活率比較見表4。

表3 35周內(nèi)液體酶解毒小雞死亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 3 The death quantity of the chicken after fed with liquid glucose oxidase in 35 weeks

表4 第35周液體酶解毒小雞存活率比較Table 4 The suvival ratio of the chicken after treated with liquid glucose oxidase in the 35th week

注:試驗(yàn)小雞未注射動(dòng)物疫苗。

液體酶解毒試驗(yàn)中，各組現(xiàn)象與固體酶解毒基本相同，兩個(gè)濃度對(duì)照組數(shù)據(jù)與固體酶實(shí)驗(yàn)中基本一致，但加酶組小雞存活數(shù)量均偏低。500 ppb濃度加酶組比對(duì)照組存活率提高19%，但與固體酶組相比下降2%；2000 ppb加酶組比對(duì)照組提高28.5%，與固體酶組相比下降11%。酶活力單位含量相同，只是喂養(yǎng)方式不同。由于小雞個(gè)體飲水情況不同，飲用量也不同，解毒效果不整齊，整體葡萄糖氧化酶攝入量少于飼料喂養(yǎng)方式，解毒效果整體下降。因此，液體酶可采用低濃度長期飲水喂養(yǎng)，以提高機(jī)體免疫力，提高解毒和抗病能力。

據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，小雞飼用含黃曲霉毒素B1的飼料后死亡的原因，主要是毒素大量聚集肝臟中，出現(xiàn)肝臟腫大、病變[11, 12]。病變的肝臟嚴(yán)重影響毒素的代謝和排除功能，形成惡性循環(huán)，直至小雞死亡。與飼料一起進(jìn)入胃腸中的葡萄糖氧化酶因環(huán)境條件合適，即可發(fā)揮作用，因此，胃腸道也是解毒場(chǎng)所，部分毒素在胃腸中被解毒，肝臟中聚集的毒素大大減少。部分葡萄糖氧化酶進(jìn)入肝臟，加速肝臟的氧化還原反應(yīng)，機(jī)體解毒過程即氧化還原反應(yīng)過程，加速毒素的代謝，維護(hù)了肝臟健康。

葡萄糖氧化酶解毒機(jī)理推測(cè)：葡萄糖氧化酶的輔基對(duì)黃曲霉毒素B1的功能原子組中呋喃環(huán)具有強(qiáng)力破壞作用，使呋喃環(huán)打開形成酸端，黃曲霉毒素B1分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而失去毒性作用。

葡萄糖氧化酶在動(dòng)物胃腸道內(nèi)還可發(fā)揮酸化劑作用，降低pH值，有利于自身各種酶保持和發(fā)揮活性作用，以加強(qiáng)和促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)的生理代謝，加強(qiáng)機(jī)體解毒和排毒功能。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

葡萄糖氧化酶用于解除小雞飼料中黃曲霉毒素B1毒性試驗(yàn)，固體酶喂養(yǎng)中，在500 ppb黃曲霉毒素B1濃度下，35周內(nèi)存活率比對(duì)照組提高21%，與自然對(duì)照組相比提高1.5%，在此濃度下，黃曲霉毒素B1毒性完全解除，小雞的生命體征恢復(fù)到正常水平；2000 ppb濃度下，存活率比對(duì)照組提高39.5%，解毒效果顯著，但存活率僅相當(dāng)于自然對(duì)照組的88.82%。

在飲用水中添加液體葡萄糖氧化酶解毒效果次于固體酶。500 ppb黃曲霉毒素B1濃度下與對(duì)照組相比，存活率提高19%；2000 ppb濃度下，存活率比對(duì)照組提高28.5%。與固體酶相比，500 ppb濃度時(shí)小雞存活率低2%；2000 ppb濃度下存活率低11%。

總之，在飼料或飲用水中加入5‰ 25U/g(mL)葡萄糖氧化酶,用于小雞35周內(nèi)解除500 ppb、2000 ppb濃度黃曲霉毒素B1效果顯著，沒有表現(xiàn)其它不良現(xiàn)象。

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