黃連木葉粗多酚的純化及其抗氧化研究

鄧冠軍 , 湯明禮 , 張 旋, 黃勝威, 吳麗芳

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 合肥 230039； 2. 中國(guó)科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家林業(yè)局能源林研究中心, 合肥 230031)

黃連木(PistaciachinensisBunge)屬于漆樹科黃連木屬落葉喬木，在中國(guó)廣泛分布。其種子平均含油率約35.05%，出油率為20%～30%[1]，具有開發(fā)優(yōu)質(zhì)食用油的潛質(zhì)[2]。黃連木樹皮、樹葉均可入藥[3]，果實(shí)、果柄和葉富含揮發(fā)油，對(duì)植物病原真菌具有一定的抑制作用[4]。此外，黃連木樹各部分都有特殊氣味，熬制的水溶液是較好的農(nóng)藥，可殺各種水稻害蟲和蚜蟲。研究顯示，黃連木的不同部位都富含多酚類物質(zhì)[5]。因此針對(duì)黃連木葉進(jìn)行多酚提取分離研究，并挖掘其生物活性，為進(jìn)一步提高對(duì)黃連木的綜合利用提供理論和技術(shù)支撐。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是很多疾病的病理發(fā)生的一個(gè)重要因素，比如腫瘤、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥的疾病等,當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生過多的ROS對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、DNA和其它生物分子都有很大的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞喪失整體性和一些功能。植物提取物具有廣泛地生物活性，其中抗氧化活性與延遲衰老和抗腫瘤等密切相關(guān)。本文采用經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速可靠的方法(DPPH和FRAP法)對(duì)純化后產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行快速評(píng)價(jià)。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)與人類基因有60%～80%同源[6]，很多生物學(xué)基礎(chǔ)和哺乳類動(dòng)物也高度一致，而且生活史短。因而，秀麗隱桿線蟲經(jīng)常被用作抗氧化、衰老和環(huán)境毒理等研究及藥物靶位點(diǎn)的篩選[7-9]。本文以線蟲為活體模型，對(duì)黃連木葉純化多酚的體內(nèi)抗氧活性進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)價(jià)，為黃連木葉多酚應(yīng)用和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為提高能源林的經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行有益探索。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

黃連木葉片2012年8月份采集于合肥市郊區(qū)，采集后殺青處理并60℃烘干，粉碎過篩(直徑為0.25 mm)。-20℃保存。

提取試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?00～300目硅膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。2，7二氯熒光素二乙酸(2，7-Dichlorofluorescein diacetate)，胡桃醌(Juglone)，1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra X-22R 離心機(jī)(Sigma)，UV-2550型紫外線可見光光度計(jì)(SHIMADZU)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SZM45-B2體視顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 供試樣品的制備黃連木葉粗多酚提取參考張旋等方法[10]。粗多酚的純化參考Tang 等[11]的方法：稱40 g硅膠粒(200～300目)，在105℃干燥30 min。將硅膠粒轉(zhuǎn)移到100 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)浸泡30 min，濕裝柱法裝柱(2.5 cm/73 cm)。 將0.40 g粗多酚溶于5 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)，混勻后上樣，用200 mL 洗脫液(氯仿∶甲醇=4∶6)進(jìn)行洗脫，流速為1秒2滴，收集洗脫液1.50 mL每管，共150 mL。將收集洗脫液用福林酚法(Folin-Ciocalteau法)檢測(cè)樣品中的多酚，發(fā)現(xiàn)多酚主要集中從30 mL到120 mL洗脫液中，共收集90 mL，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其蒸干成粉末即得到黃連木葉純化多酚。

1.3.2 多酚含量測(cè)定采用福林酚法 (Folin-Ciocalteau法)[12]。單寧含量的測(cè)定參照李靜等[13]的方法。黃酮含量的測(cè)定參照裴詠萍等[14]的方法。DPPH法測(cè)定黃連木葉多酚清除自由基能力參考王晶等[15]的方法。 FRAP法測(cè)定黃連木葉多酚抗氧化活性參考Benzie等[16]的方法。

1.3.3 黃連木葉多酚提高線蟲存活率 參考Hsu等[17]的方法。將同步化L1期N2線蟲培育于S-液體培養(yǎng)基，加入0.50 mL 大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) OP50。然后分別加入不同濃度純化多酚(0，100，200 μg/mL)。20℃培育72 h，3300 r/min離心2 min。將線蟲轉(zhuǎn)移到250 μmol/L胡桃醌(Juglone)溶液中，20℃處理200 min，24 h后計(jì)數(shù)線蟲的存活率。重復(fù)3次。

1.3.4 黃連木葉多酚對(duì)線蟲體內(nèi)ROS的抑制效應(yīng)

參考Hsu等[17]的方法。線蟲培養(yǎng)和樣品處理同1.3.3。將線蟲轉(zhuǎn)移到150 μmol/L 胡桃醌溶液中20℃處理1 h，M9離心洗滌2次。將線蟲轉(zhuǎn)移到10 μmol/L的2，7二氯熒光素二乙酸溶液，20℃處理30 min。隨機(jī)挑出線蟲放在載玻片上，5 mM鹽酸左旋咪唑(Levamisole) 麻醉，熒光體視顯微鏡觀察拍照(曝光時(shí)間4 s)。Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)分析線蟲熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)分析熒光強(qiáng)度，ANOVA法(SPASS 16.0)顯著性檢驗(yàn)。選取P< 0.05為顯著水平，線性回歸方程計(jì)算IC50(為清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度)。樣品純化率=(A1-A0)/A0*100%。(A0為黃連木葉粗多酚成分的測(cè)定參數(shù)，A1為黃連木葉多酚成分的測(cè)定參數(shù))

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連木葉粗多酚純化

本文采用二元洗脫法，并根據(jù)薄層層析預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選系統(tǒng)液以達(dá)到較好的多酚富集。黃連木葉粗多酚樣品0.4000 g經(jīng)過硅膠柱得到0.2330 g純化產(chǎn)物，純化得率為58.25%。

2.2 純化產(chǎn)物的多酚含量

采用Folin-Ciocalteau比色法測(cè)定黃連木葉多酚的多酚含量，以沒食子酸為對(duì)照品，其結(jié)果見表1。純化前后的總酚含量分別為0.8400 g和1.0125 g當(dāng)量沒食子酸每克樣品，純化后多酚含量提高了20.54%。根據(jù)硅膠粒對(duì)不同極性物質(zhì)具有不同吸附力能力，收集多酚含量高洗脫部分，從而使多酚類物質(zhì)富集，與色素類等物質(zhì)分離[18]。因此，經(jīng)過硅膠柱純化后酚類物質(zhì)的含量得到提高。

2.3 純化產(chǎn)物的單寧含量

采用福林酚-丹尼斯法(Folin-Denis法)測(cè)定單寧含量，以單寧酸為對(duì)照品，其結(jié)果見表1。黃連木葉多酚純化前后的單寧含量分別為0.7575 g和0.8600 g當(dāng)量單寧酸每克樣品，單寧含量提高了13.53%。通過硅膠柱純化后，黃連木葉提取物中酚類物質(zhì)的含量提高，而單寧與多酚類物質(zhì)的極性很接近，即和硅膠粒的吸附能力也差不多，因而在純化多酚類物質(zhì)同時(shí)也在富集單寧。

表1 黃連木葉提取物純化前后總酚、單寧和總黃酮的含量

2.4 純化產(chǎn)物的黃酮含量

采用三氯化鋁法測(cè)定黃連木葉多酚中黃酮含量，以蘆丁為對(duì)照品，結(jié)果見表1。黃連木葉多酚純化前后的黃酮含量分別為0.1297 g和0.1453 g當(dāng)量蘆丁每克樣品，黃酮提高12.03%。本文主要目的旨在提高提取物的多酚含量，未對(duì)不同性質(zhì)的多酚成分進(jìn)行分級(jí)分離。黃酮作為多酚的一部分，通過硅膠柱純化后，其含量自然也隨著黃連木葉純化產(chǎn)物中多酚類物質(zhì)的含量增加而提高[19]。

圖1 維生素C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚對(duì)DPPH·清除作用

2.5 純化產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力

黃連木葉多酚純化產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除能力見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化產(chǎn)物清除DPPH自由基能力強(qiáng)于黃連木葉粗多酚，也強(qiáng)于維生素C(Vitamin C)，但微弱于98%茶多酚。DPPH自由基清除率與酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)，說明酚類物質(zhì)在DPPH自由基清除過程中起到主要作用。黃連木多酚的清除能力沒有茶多酚強(qiáng)，可能由于純化后黃連木多酚的純度仍然沒有達(dá)到商品化茶多酚的純度。另外，DPPH自由基的清除率還與其中所含有酚類化合物的種類和極性有關(guān)，中等極性的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率較高。兩種提取物的清除能力差異也可能是所含酚類的極性不一樣導(dǎo)致的[20]。IC50(當(dāng)50%DPPH自由基被清除時(shí)的試樣濃度)的結(jié)果見表2。茶多酚、維生素C、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚純化產(chǎn)物的IC50分別為2.75 mg/L、4.03 mg/L、3.57 mg/L和3.02 mg/L，結(jié)果表明黃連木葉多酚具有比較強(qiáng)的抗氧化能力。

表2 維生素 C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚IC50和 FRAP10

2.6 FRAP法測(cè)定黃連木葉多酚純化產(chǎn)物抗氧能力

圖2 FRAP法測(cè)定維生素C、茶多酚、黃連木葉粗多酚和黃連木葉多酚的FRAP值Fig 2 FRAP values of vitamin C, tea polyphenols，crude polyphenols and polyphenols of P. chinensis leaf

由圖2可知，用FRAP法測(cè)定的黃連木葉多酚抗氧活性具有明顯的劑量效應(yīng)，純化多酚強(qiáng)于粗多酚和維生素C，但稍弱于純茶多酚。FRAP10(表10 μg/mL樣品濃度下FeSO4當(dāng)量)結(jié)果見表2?？寡趸芰ε判蚪Y(jié)果為茶多酚0.22、黃連木葉多酚0.20、黃連木葉粗多酚0.17及維生素C 0.16 (mmolFeSO4/L當(dāng)量)。FRAP法和DPPH法測(cè)定黃連木葉多酚抗氧活性弱于茶多酚，而強(qiáng)于黃連木葉粗多酚和維生素C結(jié)論是一致的，但是這兩種方法測(cè)得這4種物質(zhì)的抗氧活性在強(qiáng)弱的順序上存在差異，可能與DPPH和Fe3+提供電子能力不同和這兩個(gè)物質(zhì)還原能力不一樣以及實(shí)驗(yàn)參數(shù)衡量的參考水準(zhǔn)不一樣有關(guān)。

2.7 黃連木葉多酚純化產(chǎn)物對(duì)線蟲存活率的影響

黃連木葉多酚對(duì)胡桃醌處理后秀麗隱桿線蟲的存活率的影響見圖3。胡桃醌(Juglone) 能顯著升高線蟲體內(nèi)ROS[17]，并導(dǎo)致線蟲死亡。但是經(jīng)過黃連木葉多酚預(yù)處理后，線蟲的存活率顯著提高，說明黃連木葉多酚具有比較強(qiáng)的抗氧能力。ROS通常被認(rèn)為是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性。過量的·0和·OH氧化細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化、交聯(lián)、聚合成脂褐素(一種難以消除的惰性廢物)，導(dǎo)致脂褐素堆積在細(xì)胞內(nèi)毒害細(xì)胞。同時(shí)也對(duì)核酸進(jìn)行氧化和交聯(lián)，使發(fā)生斷裂、突變，從而嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)遺傳信息的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，阻止細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和信息的傳遞，進(jìn)而引起細(xì)胞調(diào)亡和機(jī)體衰老死亡效應(yīng)[21]。而黃連木葉多酚能有效降低ROS損傷導(dǎo)致的線蟲死亡率。

圖3 黃連木葉多酚對(duì)線蟲存活率的影響

2.8 黃連木葉多酚純化產(chǎn)物影響線蟲體內(nèi)ROS水平

為了進(jìn)一步驗(yàn)證黃連木多酚對(duì)線蟲的保護(hù)作用與清除ROS直接相關(guān)。本文對(duì)黃連木葉多酚抑制線蟲細(xì)胞內(nèi)的ROS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖4。線蟲經(jīng)過胡桃醌(Juglone)處理后產(chǎn)生高濃度ROS[22]，而不同濃度的黃連木多酚可以有效的抑制其體內(nèi)的ROS。因此，黃連木葉多酚具備開發(fā)成為新的天然抗氧化劑，并應(yīng)用于食品、保健和醫(yī)藥產(chǎn)品領(lǐng)域。

a—陽(yáng)性對(duì)照； b—50 μg/mL多酚預(yù)處理； c—100 μg/mL多酚預(yù)處理； d—200 μg/mL多酚預(yù)處理； e—抑制ROS統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖4黃連木葉多酚對(duì)線蟲體內(nèi)ROS的抑制效應(yīng)

Fig 4 The ROS inhibitory effect of polyphenols fromP.chinensisleaf

3 結(jié)論

黃連木葉粗多酚經(jīng)過硅膠柱純化后，其多酚、單寧、黃酮含量分別為1.0125 g當(dāng)量沒食子酸每克樣品、0.8600 g當(dāng)量單寧酸每克樣品和0.1453 g當(dāng)量蘆丁每克樣品。與粗多酚相比多酚含量提高了20.54%，單寧含量提高了13.53%，黃酮含量提高了12.03%。因而硅膠柱色譜法對(duì)酚類是個(gè)很好的純化方法，而且通過體內(nèi)和體外抗氧化法測(cè)定表明隨著酚類含量的提高，抗氧化活性也顯著性提高。因而黃連木葉多酚具有抗氧化性，是很好的天然抗氧化劑，具有在食品、保健等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]Li H L, Zhang Z X, Lin S Z, et al. Research advances in the study ofPistaciachinensisBunge, a superior tree species for biomass energy[J]. Forest Studies in China, 2007, 9(2): 164-168.

[2]王 鑫,馬志豪.黃連木籽油熱解產(chǎn)物氣相色譜-質(zhì)譜分析及物性測(cè)定[J].可再生能源, 2010,28(1): 72-75.

[3]祖 庸,李小龍,鄭國(guó)棟.黃連木的綜合利用[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào), 1989,19(1):55-61.

[4]陳利軍,夏新奎,陳月華,等. 黃連木葉揮發(fā)油的抑菌活性及其成分分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010，5:63-68.

[5]柳建軍,許立松,王菁菁,等．黃連木嫩葉抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2008,9( 9) : 161-165.

[6]Kaletta T, Hengartner M O. Finding function in novel targets:C.elegansas a model organism[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2006, 5:387-398.

[7]Gill M S. Endocrine targets for pharmacological intervention in aging inCaenorhabditiselegans[J]. Aging Cell, 2006, 5: 23-30.

[8]Gami M S, Wolkow C A. Studies ofCaenorhabditiselegansDAF-2/insulin signaling reveal targets for pharmacological manipulation of lifespan[J]. Aging Cell, 2006, 5:31-37.

[9]Guarente L, Kenyon C. Genetic pathways that regulate ageing in model organisms[J]. Nature, 2000,408:255-262.

[10]張 旋,湯明禮,張萍萍,等.黃連木葉的多酚提取和抗氧化研究[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2012，26(3):79-83.

[11]Tang Z H, Qin J P, Xu X N, et al. Applying silica gel column chromatography purify resveratrol from extracts ofMorusalbaL. Leaf[J]. Journal of Medicinal Plants Research, 2011, 5(14):3020-3027.

[12]張梅梅, 魏志文, 劉玉冰, 等. Folin-ciocalteu比色法測(cè)定樺褐孔菌多酚的條件優(yōu)化[J].菌物學(xué)報(bào), 2011,30(2): 295-304.

[13]李 靜, 聶繼云, 李海飛, 等.蘋果果實(shí)單寧 Folin-Denis 測(cè)定法[J].中國(guó)果樹, 2006,5:57-59.

[14]裴詠萍,李維林, 張涵慶.三氯化鋁比色法測(cè)定中藥中總黃酮含量的方法改進(jìn)[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009,23(4):58-60.

[15]王 晶, 李 麗, 劉春明, 等.不同紅藥提取物中總酚的測(cè)定及抗氧化活性的DPPH法評(píng)價(jià)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志, 2011,38(3):314-317.

[16]Benzie I F, Strain J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay[J]. Journal of Analytical Biochemistry, 1996,239(1):70-76.

[17]Hsu F L, Li W H, Yu C W, et al. In vivo antioxidant activities of essential oils and their constituents from leaves of the TaiwaneseCinnamomumosmophloeum[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012,60:3092-3097.

[18]袁 華,吳 莉 ,吳元欣，等 .硅膠柱層析法提純茶多酚的研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2007,41(4):553-556.

[19]王 勇，宋宇琴，韓玉虎，等. 核桃枝條中總酚、黃酮類化合物含量研究[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2007,24( 5):626-629.

[20]邱高翔，董娟娥，馬希漢，等.杜仲雄花提取物的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)[J].林業(yè)科學(xué)，2013,49(3)：63-69.

[21]曹 陽(yáng)，祁俊生，王遠(yuǎn)亮.自由基介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].重慶三峽學(xué)院學(xué)報(bào), 2004,20(3):118-122.

[22]Ji Y B, Qu Z Y, Zou X, et al. Effects of juglone on ROS production and mitochondrial transmembrane potential in SGC-7901 cells[J]. Information Technology and Agricultural Engineering, 2012, 134:7-14.