奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及應(yīng)用研究概況

鄺曉嬌，張世棟，董書(shū)偉，王東升，魏立琴，嚴(yán)作廷

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050）

子宮內(nèi)膜（endometrium）構(gòu)成雌性哺乳動(dòng)物子宮壁的最內(nèi)層，位于子宮腔面，在動(dòng)物生殖生理活動(dòng)中占有重要地位。正常的子宮內(nèi)膜由上皮和其下方的固有層組成。上皮層主要由具有分泌功能的子宮黏膜上皮（gland epithelium）構(gòu)成；固有層主要是子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cells）構(gòu)成的結(jié)締組織，與網(wǎng)狀纖維和基質(zhì)等成分構(gòu)成間質(zhì)［1-2］。由于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞均可受卵巢激素的影響產(chǎn)生周期性的變化，且在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中占有數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)，所以子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)主要是對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)［3-4］。細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)不僅可以直觀地對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察處理，還可以避免在體條件下多種生理因素帶來(lái)的研究干擾。因此，在子宮內(nèi)膜生殖生理相關(guān)的細(xì)胞學(xué)研究中，建立穩(wěn)定有效的子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)體系具有重要意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其相關(guān)應(yīng)用的研究不斷呈現(xiàn)新的進(jìn)展，為奶牛繁殖生理的研究提供了重要的基礎(chǔ)意義。

1 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)

早在20世紀(jì)80年代，國(guó)外學(xué)者就開(kāi)展了子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究工作。Fortier M A等［3］利用胰蛋白酶、膠原酶和DNA酶分步消化的方法首次成功分離出奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。隨后，國(guó)內(nèi)外研究者在該方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，利用組織塊培養(yǎng)、網(wǎng)篩過(guò)濾等方法相繼成功獲得了奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞［5-8］。

1.1 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)

1.1.1 樣品采集 取黃體初期至中期（發(fā)情2d～12d）未孕健康奶牛新鮮子宮（死亡10min左右），剝離脂肪組織，生理鹽水沖洗干凈，用冰冷無(wú)菌、無(wú)鈣鎂離子的 Hank′s平衡鹽溶液（IHBSS）（含青霉素100單位／mL、鏈霉素100μg／mL）保存，并置于冰上盡快送往實(shí)驗(yàn)室［5-6］。

1.1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.1.2.1 分步消化法 無(wú)菌條件下，剪開(kāi)子宮角，暴露子宮腔，取子宮內(nèi)膜組織，加入3g／L胰蛋白酶22℃水浴消化2h，胎牛血清（FBS）終止消化。收集細(xì)胞懸液，離心漂洗2遍，加入細(xì)胞分離液除去污染的血細(xì)胞，IHBSS液清洗兩遍，收集子宮內(nèi)膜細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含50μg／mL青霉素、50 μg／mL鏈霉素及100mL／L熱滅活的FBS）稀釋濃度至5×105個(gè)／mL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48h換液1次，直至細(xì)胞融合。上述除去上皮細(xì)胞的組織塊，經(jīng)消化液（含0.2g／L胰蛋白酶、0.2g／L膠原酶Ⅱ、0.15%DNaseI，IHBSS溶液配制 ）37℃水浴消化1h后，加入適量FBS終止消化。將組織塊漂洗2次，加入含100mL／L FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度下進(jìn)行組織塊培養(yǎng)。18h后更換培養(yǎng)液，所得貼壁細(xì)胞基本為子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞［6］。

1.1.2.2 篩網(wǎng)過(guò)濾法 無(wú)菌條件下將切碎的子宮內(nèi)膜組織放入25mL消化液（含0.5mg／mL胰蛋白酶Ⅲ、0.5mg／mL 膠原酶Ⅱ、1mg／mL BSA 和 0.1 mg／mL DNaseI，Hanks液配制），37℃恒溫?fù)u床消化1h～1.5h后，將細(xì)胞懸液經(jīng)孔徑40μm的篩網(wǎng)過(guò)濾，除去未消化的組織。濾液重懸于洗液（含100 mL／L FBS、3μg／mL胰蛋白酶抑制劑，HBSS液配制），100r／min離心10min，收集細(xì)胞，重新漂洗1遍后，加入 RPMI-1640培養(yǎng)基（含100mL／L FBS，50 IU／mL青霉素、50μg／mL鏈霉素和2.5μg／mL兩性霉素B），調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)／mL并接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。培育18h后，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液至另一個(gè)24孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，即可獲得上皮細(xì)胞；而前一板中先貼壁的細(xì)胞即為基質(zhì)細(xì)胞［9-10］。

1.1.2.3 組織塊培養(yǎng)法 無(wú)菌條件下，取子宮內(nèi)膜組織反復(fù)剪切至1mm3大小，用彎頭吸管吸取適量組織塊放入培養(yǎng)皿中，組織塊間距離以0.5cm為宜。倒置培養(yǎng)皿于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中2h～4h。然后正置培養(yǎng)皿，并輕輕注入少量含200mL／L FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24h后補(bǔ)加培養(yǎng)液至足量。每天觀察細(xì)胞從組織塊爬出情況，每2d～3d換液1次［7，10-12］。

1.1.2.4 組織塊消化培養(yǎng)法 無(wú)菌條件下，組織塊剪碎至1mm3大小，加入2.5g／L膠原酶Ⅰ溶液在37.5℃水浴勻速晃動(dòng)消化1h～1.5h。低速離心并收集沉淀，漂洗2次后將組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，組織塊間距0.5cm為宜，并用移液器吸去組織塊周?chē)后w，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。3h后補(bǔ)加1mL完全培養(yǎng)液以覆蓋組織塊而不漂起為準(zhǔn)，繼續(xù)培養(yǎng)。待組織塊貼壁后補(bǔ)加4mL完全培養(yǎng)液，以后每隔3d更換2／3的培養(yǎng)液，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部［8，13］。

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)能夠在體外成功分離培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，并能達(dá)到一定的純度滿足研究要求。然而，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用奶牛子宮內(nèi)膜組織體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的方法有一定差異。國(guó)外研究者使用最多的為篩網(wǎng)過(guò)濾法，即將組織塊經(jīng)過(guò)消化液消化，經(jīng)網(wǎng)篩過(guò)濾直接獲得子宮內(nèi)膜單細(xì)胞，且純度較高，常常不需要進(jìn)一步純化即可滿足實(shí)驗(yàn)要求［10，14］。但是該方法由于消化過(guò)程受溫度、時(shí)間、酶活力等影響較難控制，操作中往往造成細(xì)胞消化性損傷。損傷的細(xì)胞生長(zhǎng)性能受到影響，易老化凋亡，且其操作較為繁瑣，過(guò)濾離心等過(guò)程增加了污染的幾率。國(guó)內(nèi)研究人員多使用組織塊消化法，該法是在國(guó)外已有方法的基礎(chǔ)上作了一定的改進(jìn)。例如，簡(jiǎn)化多種消化液成分（如胰蛋白酶、膠原酶、BSA和DNaseⅠ等）為一種成分（膠原酶）；省略去除血細(xì)胞及通過(guò)網(wǎng)篩過(guò)濾等步驟；替換廣為使用的普通RPMI1640培養(yǎng)基，使用有促上皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用的DMEM／F12混合培養(yǎng)基，以提高培養(yǎng)效率等。該方法操作簡(jiǎn)單，獲得細(xì)胞形態(tài)均一，成功率較高。但是與國(guó)外技術(shù)相比，所獲得的子宮內(nèi)膜細(xì)胞純度不高，混合生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞較多，且往往需要多次純化的過(guò)程，比較麻煩?？傊绾螌?guó)內(nèi)外常用體外培養(yǎng)方法的優(yōu)勢(shì)充分結(jié)合，建立起簡(jiǎn)捷、快速、穩(wěn)定有效的體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型，并保持傳代細(xì)胞的生物學(xué)特性等的方法還有待進(jìn)一步探究。

2 體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的純化

原代培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞群主要是上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞混合生長(zhǎng)的狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室常根據(jù)二者貼壁速度和對(duì)酶的敏感度不同將其分離純化。

2.1 差速貼壁法

混合細(xì)胞懸液接種后，可在2h后更換培養(yǎng)液，此時(shí)基質(zhì)細(xì)胞已發(fā)生選擇性貼附，可將基質(zhì)細(xì)胞與血細(xì)胞和殘余的上皮細(xì)胞分離。由于上皮細(xì)胞接種后24h～48h才能貼壁，所以選擇18h后更換培養(yǎng)上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液，間質(zhì)細(xì)胞充分貼壁而被除去，更換出來(lái)的培養(yǎng)液主要含有上皮細(xì)胞，可重新接種于培養(yǎng)板，每2d更換1次培養(yǎng)液，直至細(xì)胞融合［15-16］。

2.2 差時(shí)消化法

混合態(tài)細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，加入2.5g／L胰蛋白酶，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)絕大多數(shù)成纖維細(xì)胞變圓、部分脫落時(shí)，終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，待成纖維細(xì)胞完全脫落后，收集液體繼續(xù)培養(yǎng)，所得細(xì)胞即為基質(zhì)細(xì)胞；剩余貼壁細(xì)胞即為上皮細(xì)胞，用少量培養(yǎng)基沖洗2次后，加入適量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3d左右，觀察細(xì)胞，若上皮細(xì)胞中仍明顯有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，再重復(fù)1次胰酶差時(shí)消化得到純化的細(xì)胞［12-13］。

以上兩種純化方法各有利弊。國(guó)外研究者在分離純化子宮內(nèi)膜細(xì)胞過(guò)程中先經(jīng)過(guò)網(wǎng)篩過(guò)濾，再結(jié)合差速貼壁法，利用各細(xì)胞貼壁速度不同將所需細(xì)胞分離出來(lái)。該方法操作簡(jiǎn)單，避免細(xì)胞發(fā)生變化，所得細(xì)胞純度較高，不足之處是有可能損失一定數(shù)量的細(xì)胞。差時(shí)酶消化法是國(guó)內(nèi)最常用的純化方法，其優(yōu)點(diǎn)是不僅能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶耐受性的不同，使兩者分開(kāi)，達(dá)到純化的目的，而且對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁細(xì)胞及黏附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的，但其缺點(diǎn)是消化程度很難控制，而且往往可能需要多次傳代才能達(dá)到目的，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。另外，近些年迅速發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞分選純化技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠技術(shù)，由于其具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，在分離純化某些特殊細(xì)胞時(shí)優(yōu)勢(shì)明顯［17-18］，還未在奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，有待進(jìn)一步探索。

3 體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的鑒定

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外接種24h后大部分都已貼壁，呈多邊形或蝌蚪形；2d～3d后，細(xì)胞出現(xiàn)渦旋狀生長(zhǎng)，呈現(xiàn)典型上皮細(xì)胞的鋪路石狀，細(xì)胞間形成緊密連接，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，核大而圓，核仁明顯，透明度小；連續(xù)傳代后，細(xì)胞變薄，細(xì)胞質(zhì)透明度增加，核輪廓不清，甚至出現(xiàn)“空泡樣”變化，貼壁性能逐漸下降，逐漸呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，直至凋亡。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞呈典型的成纖維樣梭形，胞漿豐富，核橢圓，在組織塊培養(yǎng)初期生長(zhǎng)迅速，呈漩渦輪層狀生長(zhǎng)，細(xì)胞之間平行連接成束，4d～5d即可融合成片［19］。

3.2 免疫組化染色

現(xiàn)已證明角蛋白存在于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)，而波形蛋白存在于基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。利用生物素等標(biāo)記的牛角蛋白抗體可使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞特異性顯色，而基質(zhì)細(xì)胞不著色；利用生物素等標(biāo)記的牛波形蛋白能使子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞染色，而上皮細(xì)胞不著色［20-21］。利用這一特點(diǎn)可以分別將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞鑒定。此外，借助圖像灰度分析技術(shù)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行圖像統(tǒng)計(jì)分析，一定程度上可判斷細(xì)胞的純度。國(guó)外研究者因?yàn)樵诩?xì)胞分離與純化過(guò)程中利用網(wǎng)篩過(guò)濾、差時(shí)貼壁等方法所獲細(xì)胞純度較高，因此常常只采用形態(tài)學(xué)觀察即可完成鑒定細(xì)胞純度是否符合實(shí)驗(yàn)要求。而國(guó)內(nèi)研究人員由于沒(méi)有網(wǎng)篩過(guò)濾等步驟，則往往需要進(jìn)一步通過(guò)免疫組化技術(shù)鑒定其純度。對(duì)于廣泛應(yīng)用于人源性細(xì)胞的STR（short tandem repeat，短串聯(lián)重復(fù)序列）分型等技術(shù)通過(guò)DNA含量、RNA和蛋白質(zhì)以及酶活性等分子生物學(xué)方法快速鑒定細(xì)胞技術(shù)日益成熟［22］，但是利用這些方法鑒定奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的報(bào)道還未見(jiàn)到。

4 奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)純化后的細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí)，采用胰蛋白酶消化細(xì)胞并進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。無(wú)菌條件下，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS液沖洗2遍，然后加入2.5g／L胰蛋白酶和0.2g／L EDTA混合液（V／V＝1∶1）1mL，置37℃培養(yǎng)箱中消化10min左右。顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞收縮變圓時(shí)，倒去消化液，加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕將細(xì)胞自瓶壁全部吹打下來(lái)。取適量吹打均勻的細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按1∶2或1∶3的比例進(jìn)行接種培養(yǎng)［6-8］。

5 體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的應(yīng)用概況

Asselin E等檢測(cè)到子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌激素分別為前列腺素F2α（PGF2α）和前列腺素E2（PGE2）；Herath S等［10］利用內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞能分泌少量PGF2α，而上皮細(xì)胞不能分泌PGE2，同時(shí)首次在奶牛子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4（TLR4）；Fischer C等［23］通過(guò)體外培養(yǎng)奶牛產(chǎn)后21d～27d子宮內(nèi)膜的上皮細(xì)胞，研究細(xì)胞中一系列炎性因子的基因表達(dá)變化與子宮內(nèi)膜炎癥的關(guān)系，結(jié)果表明CXL趨化因子5（CXCL5）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素8（IL-8）和腫瘤壞死因子（TNF）等基因可作為隱性子宮內(nèi)膜炎診斷和治療的監(jiān)測(cè)指標(biāo)；Swangchan-uthai T等［20］利用體外細(xì)胞炎癥模型研究了炎癥發(fā)生過(guò)程中TLR4／CD14／MD2信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞因子（IL-1β、TNFα）、趨化因子（IL-8、CXCL5）、抗菌肽（LAP、S100A8、S100A9、S100A12）、金屬蛋白酶（MMP1、MMP13）以及前列腺素合成酶等蛋白及其基因表達(dá)變化的特征，揭示了S100族Ca2＋結(jié)合蛋白在炎癥發(fā)生過(guò)程中的抗菌作用以及奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞在LPS刺激時(shí)的基因表達(dá)模式；Cronin J G 等［9］利用體外細(xì)胞炎癥模型的研究表明，奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)TLR4／MYD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮先天免疫功能；Chapwanya A等［14］對(duì)體外上皮細(xì)胞的應(yīng)用研究表明急性期蛋白基因SAA3的表達(dá)變化很可能為奶牛子宮內(nèi)膜炎癥診斷和治療提供新方案；Turner M L等［24］的研究表明奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)TLR2、TLR1和TLR6等受體對(duì)LPS產(chǎn)生更為廣泛的炎癥應(yīng)答機(jī)制。

近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)奶牛子宮生理功能和炎癥反應(yīng)機(jī)理等分子細(xì)胞學(xué)水平研究的重視，在學(xué)習(xí)國(guó)外先進(jìn)技術(shù)的同時(shí)，緊密結(jié)合我國(guó)奶牛子宮疾病研究現(xiàn)狀，有關(guān)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和體外應(yīng)用的工作不斷展開(kāi)，新的研究成果也不斷涌現(xiàn)。張明等［25］以不同濃度的孕酮處理體外混合培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著孕酮濃度的增加孕酮受體（PR）基因表達(dá)量逐漸下降，雖然這與Xiao W C等把子宮內(nèi)膜細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)的研究結(jié)果存在一定差異，但更好地豐富了激素的作用模式；杜金梁等［26］在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了奶牛子宮內(nèi)膜炎體外細(xì)胞模型的研究，并利用該細(xì)胞模型探討了益母生化散對(duì)治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用機(jī)理；張桂林等［27-28］發(fā)現(xiàn)LPS對(duì)體外奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的毒性作用呈濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)，并證明奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中存在LPS介導(dǎo)的NF-kB信號(hào)通路；劉珊［29］通過(guò)體外試驗(yàn)利用脂磷壁酸（LTA）、LPS、孕酮（P）和雌二醇（E2）建立細(xì)胞模型，證明E2、P對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞免疫水平的影響可以通過(guò)調(diào)節(jié)TLRs的表達(dá)及誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子和炎癥趨化因子來(lái)實(shí)現(xiàn)；吳岳［13］通過(guò)上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及研究發(fā)現(xiàn)在奶牛早期IFN-τ對(duì)奶牛子宮上皮細(xì)胞MICB和BoLA-A的表達(dá)均具有顯著的抑制作用，這種抑制作用對(duì)于胎兒逃避母體免疫系統(tǒng)識(shí)別、保證正常著床起關(guān)鍵作用；肖雅等［21］則通過(guò)IFN-τ干預(yù)奶牛子宮上皮細(xì)胞中BoLA-I重鏈的表達(dá)，為探索IFN-τBoLA-I重鏈—子宮上皮細(xì)胞之間的免疫調(diào)節(jié)通路提供依據(jù)。

綜上所述，奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)模型主要應(yīng)用于奶牛子宮內(nèi)膜生理機(jī)能、發(fā)病機(jī)制及藥物篩選等方面的研究。相比之下，人和小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)體系較為成熟，其體外細(xì)胞模型已廣泛用于人婦產(chǎn)科、生殖醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等多種領(lǐng)域的研究［30-31］，這對(duì)獸醫(yī)領(lǐng)域中奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的類(lèi)似研究具有很好的指導(dǎo)和借鑒意義。

6 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，目前已經(jīng)能夠在體外成功分離培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，并能達(dá)到一定的純度滿足研究要求。研究人員利用建立的體外細(xì)胞模型，結(jié)合免疫組織化學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)以及分子生物學(xué)的研究方法，已經(jīng)對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生理功能和一些作用機(jī)制有了更深層次的研究。但是，如何優(yōu)化目前所用的體外培養(yǎng)方法，簡(jiǎn)便、快速地立穩(wěn)定有效的奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，并借鑒人［32］、山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞［33］、奶牛乳腺上皮細(xì)胞［34］等體外永生化研究，使得牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)體外無(wú)限增殖且細(xì)胞間無(wú)差異成為可能，還須進(jìn)一步的研究。另外，利用子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外模型在研究奶牛子宮內(nèi)膜生殖生理及炎癥機(jī)制等方面，雖已發(fā)現(xiàn)部分相關(guān)信號(hào)通路及藥物作用靶標(biāo)，但仍涉及大部分作用機(jī)理尚不清楚，相應(yīng)藥物臨床治療還不成型等一系列難題。隨著研究的進(jìn)一步深入，有望找到更完善的奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，進(jìn)而將其用于胚胎著床期、妊娠期生理變化、藥物篩選以及子宮抗炎機(jī)制等方面的研究，從而為揭示奶牛子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病奠定一定基礎(chǔ)。

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