應(yīng)用兩種Ⅳ型膠原α5抗體診斷Alport綜合征的比較

張明超　曾彩虹

Alport綜合征(AS)是以血尿、感音神經(jīng)性耳聾及進(jìn)行性腎功能減退為臨床特點(diǎn)的遺傳性腎臟疾病。目前國(guó)內(nèi)外診斷該病常根據(jù)臨床特點(diǎn)、家族史、腎活檢標(biāo)本電鏡檢查、遺傳學(xué)診斷及免疫組織化學(xué)診斷等方法[1-3]。該病發(fā)病機(jī)制是編碼Ⅳ型膠原α鏈基因突變導(dǎo)致基膜損傷。其中采用抗Ⅳ型膠原不同α鏈單克隆抗體,對(duì)腎活檢及皮膚活檢組織行免疫熒光染色,對(duì)X連鎖型AS患者的診斷、基因攜帶者的篩查及遺傳型的判斷有重要價(jià)值[ 4-6]。雖然越來越多的證據(jù)表明Ⅳ型膠原α5鏈正常也不能排除遺傳性腎臟疾病的可能，但是Ⅳ型膠原α5鏈異常仍然是診斷遺傳性腎臟疾病的重要手段。目前，市場(chǎng)上有兩個(gè)公司提供檢測(cè)Ⅳ型膠原α5鏈抗原，既往研究也以這兩家公司的抗體為主，我們的目的是檢驗(yàn)和比較Cosmo公司與Wieslab公司Ⅳ型膠原α5抗體在AS患者腎組織及皮膚組織的染色差異，為實(shí)際工作提供幫助。

材料和方法

腎活檢和皮膚活檢選擇2013年1～3月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科住院行腎活檢的患者26例，所有患者腎臟冰凍組織均行Ⅳ型膠原α5鏈染色，其中15例患者同時(shí)接受皮膚活檢，皮膚組織行石蠟包埋。所有標(biāo)本利用兩家公司的抗體平行比較，單克隆鼠抗人Ⅳ型膠原α5抗體(Wieslab 克隆號(hào)ALP105)用間接免疫熒光法，單克隆鼠抗人Ⅳ型膠原α5抗體(Cosmo BioUSA 克隆號(hào)CFT-45325)用直接免疫熒光法。

Wieslab間接免疫熒光法3 μm冰凍切片，吹干30 min，PBS沖洗10 min，單克隆鼠抗人Ⅳ型膠原α5抗體(Wieslab克隆號(hào)ALP105)1∶40，室溫孵育2h，PBS沖洗5 min，切片滴加FITC標(biāo)記的兔抗鼠免疫球蛋白IgG(Dako)，室溫孵育30 min，水洗，干燥，水性甘油封片。

Cosmo直接免疫熒光法3 μm冰凍切片，吹干30 min，PBS沖洗10 min，單克隆鼠抗人Ⅳ型膠原α5抗體(Cosmo BioUSA 克隆號(hào)CFT-45325)1∶40，室溫孵育2h，水洗，干燥，水性甘油封片。

皮膚石蠟切片染色新鮮皮膚組織固定于丙酮-氯仿液中，固定>12h，浸蠟，包埋，切片，石蠟包埋，3 μm切片，60℃烤片2h，二甲苯脫蠟，丙酮脫水，干燥，0.5%的胰酶消化8 min，尿素處理10 min，分別滴加一抗(Wieslab 克隆號(hào)ALP105 和Cosmo BioUSA克隆號(hào)CFT-45325)均按照1∶10稀釋，Wieslab利用間接免疫熒光法， Cosmo BioUSA利用直接免疫熒光法。

結(jié)果判斷腎組織中腎小球基膜(GBM)染色強(qiáng)度正常為2+，節(jié)段缺失或減弱為1+，完全缺失為0，400倍視野下觀察腎小管基膜(TBM)數(shù)量正常為2+，減少或減弱為1+，完全無為0，腎小球包囊正常為2+，節(jié)段缺失或減弱為1+，完全缺失為0，皮膚組織染色基膜正常為2+，節(jié)段缺失為1+，完全缺失為0。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，等級(jí)資料用中位數(shù)(25%分位數(shù)～75%分位數(shù)表示)，組間比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

兩種抗體在腎組織及皮膚組織染色結(jié)果見表1。

利用Wieslab公司Ⅳ型膠原α5抗體間接免疫熒光法染色，26例腎活檢冰凍組織中GBM 4例完全缺失，2例節(jié)段缺失，20例正常；TBM 3例無，4例減少，19例正常；包囊2例完全缺失，4例節(jié)段缺失，2例減弱，18例正常。15例皮膚石蠟組織，6例完全缺失，1例節(jié)段缺失，8例正常。

利用Cosmo BioUSA公司Ⅳ型膠原α5抗體直接免疫熒光法染色，26例腎活檢冰凍組織中GBM 4例完全缺失，4例節(jié)段缺失，1例減弱，17例正常；TBM 3例無，3例減少，20例正常；包囊2例完全缺失，5例節(jié)段缺失，2例減弱，17例正常。15例皮膚石蠟組織，6例完全缺失，6例節(jié)段缺失，3例正常。

腎臟冰凍組織中，利用兩家公司對(duì)GBM染色發(fā)現(xiàn)，第20、22例染色不一致，Wieslab公司染色GBM正常，Cosmo BioUSA公司染色可疑節(jié)段缺失(圖1)，經(jīng)電鏡證實(shí)這兩例病例非遺傳性腎臟疾病，第26例染色強(qiáng)度不一，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異，對(duì)診斷結(jié)果無影響。第3、20、21例TBM數(shù)量不一(圖2)，由于TBM數(shù)目缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，判斷減少較難，統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異，對(duì)于診斷結(jié)果無影響。第24包囊不一致(圖3)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)于診斷結(jié)果亦無影響。15例皮膚石蠟組織中第2、8、11、21、23例不一致，Wieslab公司Ⅳ型膠原α5抗體染色均為正常，而Cosmo BioUSA公司Ⅳ型膠原α5抗體染色均節(jié)段缺失(圖4)，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.031)。26例腎組織中GBM 1例強(qiáng)度不一致，2例分布不一致，TBM強(qiáng)度 3例不一致，包囊1例分布不一致。15里皮膚組織染色中5例分布不一致。

表1　應(yīng)用不同抗體對(duì)腎組織及皮膚組織行Ⅳ型膠原α5染色情況

圖1　同一患者的腎組織Ⅳ型膠原α5染色，Wieslab公司抗體(A)腎小球基膜正常表達(dá)(↑)，Cosmo BioUSA 公司抗體(B)腎小球基膜節(jié)段減弱(↑)(IF，×400)

圖2　同一患者的腎組織Ⅳ型膠原α5染色，Cosmo BioUSA公司抗體(A)和Wieslab公司抗體(B)腎小管基膜數(shù)量(IF，×400)

圖3　同一患者的腎組織Ⅳ型膠原α5染色，Wieslab公司抗體(A)腎小球包囊正常表達(dá)(↑)，Cosmo BioUSA公司抗體(B)包囊節(jié)段表達(dá)(↑)(IF，×400)

圖4　同一患者的皮膚組織Ⅳ型膠原α5染色，Wieslab公司抗體(A)基膜正常表達(dá)，Cosmo BioUSA公司抗體(B)節(jié)段表達(dá)且減弱(IF，×200)

討　　論

Ⅳ型膠原分子是由3條α鏈擰成的三螺旋結(jié)構(gòu)蛋白。Ⅳ型膠原分子各α鏈在皮膚和腎組織中的側(cè)重表達(dá)不同,在皮膚組織中,α5α5α6三螺旋分子在表皮基膜呈線狀表達(dá),皮膚組織中無α3及α4鏈表達(dá),在腎組織中,α3α4α5三螺旋分子存在于GBM、包囊、遠(yuǎn)端腎小管及集合管基膜,α5α5α6三螺旋分子僅表達(dá)于包囊、遠(yuǎn)端腎小管及集合管基膜[7-9]。正常人皮膚基膜是連續(xù)表達(dá)的。在遺傳性腎臟疾病中，尤其AS患者中α5鏈在GBM中表達(dá)減弱、缺失或完全缺失，包囊正?；蛉笔?，TBM減少或缺失；皮膚節(jié)段缺失或完全缺失。這對(duì)于AS診斷起了很大的作用。近年來，對(duì)遺傳性腎臟疾病認(rèn)識(shí)不斷加深，通過檢測(cè)皮膚基膜Ⅳ型膠原α5鏈，亦能夠確診大多數(shù)AS患者[10-13]。

利用Cosmo BioUSA公司Ⅳ型膠原α5抗體染色發(fā)現(xiàn)1例腎小球包囊壁節(jié)段缺失，該患者共2個(gè)腎小球，1個(gè)正常，而Wieslab公司Ⅳ型膠原α5抗體染色均正常，可能是切片原因，所以診斷時(shí)需綜合判斷。對(duì)于TBM數(shù)目的判斷較難，其與切片影響很大?？傮w發(fā)現(xiàn)，Wieslab公司Ⅳ型膠原α5抗體間接免疫熒光法染色更加敏感，總體染色強(qiáng)度稍強(qiáng)，可能是間接法比直接法放大了信號(hào)，但在腎組織中染色結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)診斷結(jié)果無影響。如果能接受染色強(qiáng)度的差異，Cosmo BioUSA公司Ⅳ型膠原α5抗體直接免疫熒光法染色，更加特異，更省時(shí)間。皮膚組織Ⅳ型膠原α5染色較困難，技術(shù)要求高，首先是新鮮組織放入丙酮和氯仿的混合固定液中固定12h，然后進(jìn)行浸蠟，包埋，切片，需要二甲苯脫蠟，丙酮脫水，干燥，均與常規(guī)石蠟標(biāo)本處理不同，在Wieslab試劑盒中有針對(duì)皮膚組織染色的尿素試劑，需要胰酶和尿素兩步處理，染色結(jié)果比較理想。而Cosmo BioUSA公司Ⅳ型膠原α5抗體試劑盒無尿素處理試劑，其產(chǎn)品說明書表明皮膚染色不是很準(zhǔn)確，染色強(qiáng)度比較弱，我們利用同Wieslab試劑盒同樣的方法處理皮膚，雖然部分標(biāo)本染色取得很好的結(jié)果，但總體不理想。

圖5　Cosmo BioUSA公司抗體Ⅳ型膠原α5染色。A：正常新鮮冰凍腎組織切片；B：-20℃放置3月后冰凍腎組織切片(IF，×400)

另外，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，取一部分冰凍切片置于-20℃冰箱3月后，取出吹干，按照同樣操作步驟發(fā)現(xiàn)，Wieslab試劑盒的Ⅳ型膠原α5抗體染色結(jié)果無較大變化，而Cosmo BioUSA公司Ⅳ型膠原α5抗體較多染色減弱，甚至出現(xiàn)陰性結(jié)果(圖5)，而從-70℃冰箱的包埋組織切片后染色，兩公司抗體染色均可取得較好的結(jié)果，且無明顯差異。我們認(rèn)為，以冰凍組織包埋保存在-70℃冰箱較為合適。對(duì)于皮膚石蠟組織，我們分別調(diào)取1、3、6月的正常皮膚石蠟組織發(fā)現(xiàn)，Wieslab試劑盒的Ⅳ型膠原α5抗體染色分別為正常、減弱或節(jié)段缺失； Cosmo BioUSA公司Ⅳ型膠原α5抗體染色分別為正常、減弱、節(jié)段缺失或陰性(圖6)。可能由于皮膚組織固定劑的原因，不能很好的保存抗原，但對(duì)于其他能很好保存抗原的固定劑，Ⅳ型膠原α5抗體無法進(jìn)行染色。為此對(duì)于皮膚組織進(jìn)行Ⅳ型膠原α5染色的時(shí)候盡可能選擇1月內(nèi)的陽性標(biāo)本作為對(duì)照。我們保存方法是否有問題，有待進(jìn)一步研究分析。

圖6　皮膚石蠟組織Cosmo Biousa公司抗體Ⅳ型膠原α5染色(IF，×400)

電鏡是診斷AS的金標(biāo)準(zhǔn)，AS在電鏡下有其特征性的表現(xiàn)，GBM廣泛厚薄不一及致密層分裂，免疫熒光染色和電鏡的結(jié)合是診斷遺傳性腎臟疾病的必要條件[14-15]，Ⅳ型膠原α5染色結(jié)果和電鏡結(jié)果應(yīng)一致。本組26例患者經(jīng)電鏡證實(shí)7例為AS，與利用Wieslab試劑盒的Ⅳ型膠原α5抗體染色結(jié)果完全一致。我們利用兩種方法和兩種抗體對(duì)腎組織和皮膚組織進(jìn)行染色，雖然腎組織染色結(jié)果無太大差別，但是在皮膚組織中差異較大，根據(jù)光鏡和電鏡判斷6例患者并非AS，由此說明該抗體不適應(yīng)皮膚組織染色。總之，兩家公司抗體在腎組織染色中發(fā)現(xiàn)只存在強(qiáng)度上的差異，在陽性和陰性間無差異，對(duì)診斷無影響；而在皮膚組織中有較大差異，Wieslab公司更加可靠，可能的原因是直接法不夠敏感，對(duì)于節(jié)段性病變不能準(zhǔn)確反映。

小結(jié)：Wieslab試劑盒的Ⅳ型膠原α5抗體是目前唯一通過論證的診斷試劑盒，價(jià)格比較昂貴，是Cosmo BioUSA公司試劑盒價(jià)格的兩倍，且由于Wieslab試劑盒用量比較大，目前已出現(xiàn)全球斷貨1年。對(duì)于腎組織染色，Cosmo公司的Ⅳ型膠原α5抗體可代替Wieslab公司試劑盒抗體，Cosmo BioUSA公司試劑盒是直接法，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)，但對(duì)于皮膚石蠟組織，Cosmo BioUSA公司試劑盒染色結(jié)果較差，不可替代Wieslab公司試劑盒。

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