熱激處理和檸檬酸提高發(fā)芽糙米中植酸酶活性

李 欣，陳 威，何 敏

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510430；2.廣東省糧食科學(xué)研究所，廣東廣州510050）

熱激處理和檸檬酸提高發(fā)芽糙米中植酸酶活性

李 欣1，陳 威2，何 敏1

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510430；2.廣東省糧食科學(xué)研究所，廣東廣州510050）

研究了熱激處理和檸檬酸發(fā)芽介質(zhì)對(duì)糙米的內(nèi)源植酸酶活性的影響，并采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了熱激處理?xiàng)l件。結(jié)果表明，隨著熱激時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米中植酸酶的活性逐漸升高，達(dá)到峰值后下降。利用中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證的優(yōu)化的熱激和浸泡條件為，熱激溫度50℃，熱激時(shí)間30min，浸泡時(shí)間6h。以2mmol/L檸檬酸緩沖液（pH5.2）作為發(fā)芽介質(zhì)，植酸酶活性隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，先升高后下降；發(fā)芽3d，植酸酶活性達(dá)到最高值（241.27U/kg），高于原料糙米（115.57U/kg）。本工藝提高了發(fā)芽糙米的內(nèi)源植酸酶活性，為開發(fā)糙米食品中降低植酸和保持營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

植酸酶，發(fā)芽糙米，熱激處理，檸檬酸，響應(yīng)面分析

糙米中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和活性成分，同時(shí)含有較高的植酸，含量為12.7～21.6mg/kg，可螯合Zn、Fe等礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素，從而造成微量礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)攝入不足[1-2]。因此，開發(fā)糙米食品時(shí)，應(yīng)降低植酸含量，提高礦物質(zhì)的利用率。發(fā)芽、浸泡、蒸煮和發(fā)酵等加工方法常用于降低植酸含量，其本質(zhì)上是植酸酶在起作用[2-3]。但是糙米的植酸酶活性相對(duì)較低[2]，如何充分激活糙米中的內(nèi)源植酸酶削減植酸的含量成為亟需解決的問題。糙米發(fā)芽技術(shù)是目前主要的降低植酸含量的手段之一。研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)芽溫度的提高和發(fā)芽時(shí)間的持續(xù)，糙米在谷氨酸脫羧酶、α-淀粉酶和植酸酶等激活的內(nèi)源酶作用下，不僅活性物質(zhì)如γ-氨基丁酸的含量增加，而且糊化性能和適口性等發(fā)生了極大改善[4-6]，同時(shí)糙米中植酸的含量逐步下降[3，7]。發(fā)芽條件，如浸泡液的種類、浸泡溫度和時(shí)間、發(fā)芽溫度和時(shí)間等對(duì)糙米植酸酶和植酸的影響的研究已有一些報(bào)告[7-10]，如Ou等[8]研究指出，25℃是最適合的浸泡和發(fā)芽溫度，浸泡糙米24h后，植酸酶活性明顯降低，發(fā)芽5d植酸酶活性達(dá)到峰值；研究亦發(fā)現(xiàn)，0.5mmol/L CaCl2和0.1mol/L H2O2浸泡液提高了糙米的發(fā)芽率，但浸泡液的pH影響了細(xì)胞膜的通透性，pH過高或者過低均影響到糙米的風(fēng)味改變，中性去離子水是最理想的浸泡液。作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽過程中糙米的帶菌量增加，糙米的發(fā)芽率并不穩(wěn)定（數(shù)據(jù)未顯示），這與發(fā)芽介質(zhì)關(guān)系密切。從上述研究中可以看到，浸泡時(shí)間對(duì)植酸酶的活性影響突出，浸泡過程中植酸酶是下降的，在發(fā)芽階段先升高后下降，明顯存在時(shí)間滯后現(xiàn)象，盡快激活糙米中內(nèi)源酶體系，降低植酸含量，穩(wěn)定控制浸泡和發(fā)芽條件，減少營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，從而有益于發(fā)芽糙米產(chǎn)品的開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)利用高溫短時(shí)熱激糙米，與恒定的浸泡溫度（25℃）形成短時(shí)的溫度梯度，激活糙米的內(nèi)源酶體系，研究植酸酶的變化規(guī)律，并用響應(yīng)面法優(yōu)化熱激浸泡條件；同時(shí)，探討了發(fā)芽過程中檸檬酸對(duì)植酸酶的活性影響，為充分利用發(fā)芽糙米中的植酸酶提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秈稻谷 品種為野絲占，產(chǎn)地廣東；硝酸、三水合乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸等試劑 均為分析純，購(gòu)自廣州市化學(xué)試劑廠；植酸鈉、鉬酸銨、磷酸二氫鉀（KH2PO4）和釩酸鹽 均為分析純，購(gòu)自Sigma公司。

SATAKE-THU35C檢驗(yàn)礱谷機(jī) 日本佐竹機(jī)械（蘇州）有限公司；梅特勒AB204-S型電子天平 上海梅特勒公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；2-16kt臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；721分光光度計(jì) 上海分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別稱取50g糙米，選擇40、45、50、55、60℃去離子水浸泡糙米35min進(jìn)行熱激溫度對(duì)植酸酶影響的單因素實(shí)驗(yàn)；以55℃去離子水浸泡20、25、30、35、40min進(jìn)行熱激時(shí)間對(duì)植酸酶影響的單因素實(shí)驗(yàn)；選擇未經(jīng)激活處理的糙米進(jìn)行6、12、18、24、30h浸泡，研究浸泡時(shí)間對(duì)植酸酶影響的單因素實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果固定浸泡溫度為25℃，米水比例為1∶5（w/v）。以上單因素實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組合均重復(fù)三次。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇熱激溫度（A，℃）、熱激時(shí)間（B，min）和浸泡時(shí)間（C，h）為自變量，以植酸酶為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用Design Expert 7.1.3進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of experiment

1.2.3 不同發(fā)芽介質(zhì)實(shí)驗(yàn) 分別選取100粒糙米，用去離子水和2mmol/L檸檬酸緩沖液（pH5.2）作為糙米發(fā)芽介質(zhì)，測(cè)定發(fā)芽勢(shì)（3d）和發(fā)芽率（7d）以及隔天取樣測(cè)定植酸酶活性，每天更換發(fā)芽介質(zhì)。所有實(shí)驗(yàn)組合重復(fù)三次。

1.2.4 植酸酶測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]的方法測(cè)定發(fā)芽糙米中植酸酶的活性。一個(gè)酶活單位（U）定義為在37℃，pH5.5條件下，每分鐘從植酸中釋放1μmol磷需要的酶量。以磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶液和鉬酸銨顯色混合液（含100g/L鉬酸銨，2.35g/L釩酸鹽，5mol/L硝酸，比例為1∶1∶2）反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取約3g糙米樣品于容量瓶中，加入40mL 0.22mol/L乙酸鈉緩沖溶液（pH5.4），4℃浸提1h?；旌弦河?400×g轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液待測(cè)。以1mL 10mmol/L植酸鈉做底物，與3mL酶提取液37℃孵育1h，加入4mL鉬酸銨混合顯色液終止反應(yīng)，取反應(yīng)混合液于4400×g轉(zhuǎn)速下離心10min，測(cè)定上清液在415nm處的吸光度。計(jì)算公式如下：

式中：Y為植酸酶活性，U/kg；C為根據(jù)吸光度和校準(zhǔn)曲線計(jì)算的酶活性，U；m為樣品質(zhì)量，g；F為稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)，Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，糙米用70℃熱水熱激1h，發(fā)芽率不穩(wěn)定，僅為10%～40%，因此，本研究的熱激溫度設(shè)計(jì)為40～60℃。用不同的熱激溫度處理糙米35min后測(cè)定糙米的植酸酶活性，結(jié)果表明，40、45、50、55、60℃熱激處理糙米，植酸酶的活性均高于原料糙米（115.57U/kg），隨著熱激溫度的升高，呈先升高后降低的趨勢(shì)，50℃熱激處理的植酸酶活性最高（圖1）。該結(jié)果顯示植酸酶對(duì)高溫具有一定的耐受性，與溫度對(duì)大麥中植酸酶的影響結(jié)果相似[9]，說明短時(shí)的高溫處理，激活了糙米的內(nèi)源酶體系，增加了蛋白酶的合成，相應(yīng)提高了植酸酶的活性，也有利于釋放植酸中的磷，為調(diào)節(jié)糙米萌發(fā)提供代謝底物。由此可見，篩選適合的熱激溫度可調(diào)節(jié)糙米中植酸酶的活性。

圖1 熱激溫度對(duì)糙米植酸酶活性影響Fig.1 Effect of treatment temperature on phytase activity of brown rice

用55℃熱激處理糙米，20～35min內(nèi)隨著熱激時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米中植酸酶的活性逐漸升高，35min植酸酶活性最大；超過35min，植酸酶活性開始下降（圖2）。這一結(jié)果表明，植酸酶的活性提高耗用了大量的蛋白酶源，若持續(xù)升高則不利于進(jìn)一步萌發(fā)生理代謝，因此，出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。該結(jié)果也說明并不是熱激時(shí)間越長(zhǎng)植酸酶的活性就越高，而是存在一個(gè)最適熱激時(shí)間范圍。

圖2 不同熱激時(shí)間對(duì)糙米植酸酶的影響Fig.2 Effect of heat treatment duration on phytase activity of brown rice

測(cè)定不同的浸泡時(shí)間（25℃，去離子水浸泡）對(duì)糙米的植酸酶活性的影響，結(jié)果表明，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米的植酸酶活性下降，浸泡24h植酸酶活性下降50%左右（原料糙米的植酸酶活性為115.57U/kg）（圖3）。該結(jié)果與OU等的研究利用0.5mmol/L CaCl2和水浸泡糙米24h后的結(jié)果一致[8]，研究同時(shí)認(rèn)為浸泡導(dǎo)致了植酸含量的減少，這就說明浸泡過程中植酸的減少，可能是增加了細(xì)胞的通透性造成，而不是啟動(dòng)植酸酶降解植酸，僅利用浸泡處理并沒有完全激活植酸酶活性。綜合考慮，選擇12h作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心值。

圖3 不同浸泡時(shí)間對(duì)糙米植酸酶的影響Fig.3 Effect of steeping duration on phytase activity of brown rice

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)值見表2，回歸方程為Y=169.38+ 0.28A+3.76B-1.51C+10.40AB-2.95AC+0.23BC-30.03A2-7.20B2-21.40C2。

方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明（表3），對(duì)響應(yīng)面值所建立的回歸方程模型極其顯著（p＜0.0001），失擬誤差不顯著（p=0.7436），模型的R2=0.9913，R2adj=0.9802，說明該模型的擬合程度較好，因此可用該模型預(yù)測(cè)和分析熱激浸泡糙米中植酸酶活性。熱激溫度、浸泡時(shí)間對(duì)植酸酶的影響不顯著，熱激時(shí)間則影響顯著，熱激溫度和時(shí)間存在顯著交互作用。隨著熱激溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米中植酸酶活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)（圖4）。

利用軟件優(yōu)化程序，優(yōu)化的熱激和浸泡條件為：熱激溫度50℃，熱激時(shí)間30min，浸泡時(shí)間6h，糙米中植酸酶活性的預(yù)測(cè)值為169.38U/kg。經(jīng)五次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際的植酸酶活性平均值為167.71U/kg，預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1%。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)值Table 2 Experiment design and result of response surface method analysis

圖4 熱激溫度和時(shí)間對(duì)糙米中植酸酶活性的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surfaces on phytase activities of brown rice treated by combination of temperature and time

2.3 不同發(fā)芽介質(zhì)對(duì)糙米植酸酶的影響

去離子水和2mmol/L檸檬酸緩沖液（pH5.2）分別作為糙米發(fā)芽的介質(zhì)，測(cè)定發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，結(jié)果顯示（表4），當(dāng)糙米在2mmol/L檸檬酸緩沖液（pH5.2）中發(fā)芽時(shí)，發(fā)芽勢(shì)比去離子水介質(zhì)發(fā)芽勢(shì)高，無(wú)顯著差異（p=0.078）；而發(fā)芽率則明顯高于去離子水介質(zhì)的發(fā)芽率（p=0.002），且糙米的風(fēng)味未發(fā)生改變。這可能是酸性介質(zhì)抑制了一些危害糙米發(fā)芽的微生物，從而對(duì)糙米起到保護(hù)作用。

表3 方差分析與顯著性檢驗(yàn)Fig.3 Analysis of variance and significance test

表4 不同發(fā)芽介質(zhì)對(duì)糙米發(fā)芽的影響Table 4 Effect of germination mediums on germination of brown rice

研究糙米發(fā)芽過程中植酸酶的活性變化發(fā)現(xiàn)，在去離子水介質(zhì)和檸檬酸介質(zhì)中，植酸酶活性隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，先升高后下降，酸性的檸檬酸介質(zhì)中糙米的植酸酶活性在發(fā)芽2d超過未發(fā)芽糙米（115.57U/kg），3d達(dá)到最高值（241.27U/kg），而去離子水介質(zhì)中糙米的植酸酶出現(xiàn)峰值時(shí)間滯后，3d超過未發(fā)芽糙米，4d到達(dá)最高值（圖5）。這一結(jié)果與稻谷、玉米、大豆等谷物發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[10]，在發(fā)芽前期植酸酶達(dá)到峰值，而發(fā)芽后期養(yǎng)分消耗等因素影響了植酸酶的進(jìn)一步合成，酶活性下降。酸性檸檬酸介質(zhì)促進(jìn)發(fā)芽糙米更快達(dá)到峰值減少養(yǎng)分的進(jìn)一步消耗，同時(shí)有研究認(rèn)為檸檬酸可以有效改善大米中內(nèi)源酶的作用方式，提高大米的糊化效果，改善米飯品質(zhì)[11]，本研究則表明酸性的檸檬酸介質(zhì)還能提高植酸酶活性，從而降低抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸的含量，有利于開發(fā)發(fā)芽糙米產(chǎn)品。因此，低濃度的酸性檸檬酸介質(zhì)是一種可利用的糙米發(fā)芽介質(zhì)。

圖5 不同發(fā)芽介質(zhì)中糙米植酸酶的活性變化Fig.5 Changes of pytase activities of brown rice germinated in different mediums

3 結(jié)論

3.1 短時(shí)的高溫處理，激活了糙米的內(nèi)源酶體系，從而提高了植酸酶的活性，隨著熱激時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米中植酸酶的活性逐漸升高，達(dá)到峰值后下降。糙米經(jīng)去離子水浸泡后，增加了細(xì)胞的通透性但并沒有完全激活植酸酶活性，數(shù)值低于未浸泡的糙米原料。3.2 利用中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)Design Expert 7.1.3軟件數(shù)據(jù)擬合得到二次回歸方程如下：Y=169.38+ 0.28A+3.76B-1.51C+10.40AB-2.95AC+0.23BC-30.03A2-7.20B2-21.40C2；預(yù)測(cè)并驗(yàn)證的優(yōu)化的熱激和浸泡條件為：熱激溫度50℃，熱激時(shí)間30min，浸泡時(shí)間6h。

3.3 低濃度的檸檬酸緩沖液是一種可利用的糙米發(fā)芽介質(zhì)。2mmol/L檸檬酸緩沖液（pH5.2）可提高糙米的發(fā)芽率；隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，植酸酶的活性先升高后下降，發(fā)芽2d后超過原料糙米（115.57U/kg），3d達(dá)到最高值（241.27U/kg）。

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Increase of phytase activity in brown rice treated by heat shock and germinated in citric acid medium

LI Xin1，CHEN Wei2，HE Min1
（1.Guangdong Vocational College of Science and Trade，Guangzhou 510430，China；2.Guangdong Institute of Cereal Science，Guangzhou 510050，China）

Brown rice were treated by short-time heat-shock and germinated in acidic medium to investigate changes of endogenous phytase activities，and the experiments were performed to optimize conditions of heat shock by using response surface design.The results showed that activity of phytase increased with increasing heat-shock duration，then declined after reaching peak value.The conditions of heat shock treatment and soaking time，which were optimized and validated by using central composite response surface design，were heat-shock temperature of 50℃，heat shock time of 30min，and soaking time of 6h.As the germination time extension，phytase activities of brown rice germinated in citrate buffer（2mmol/L，pH5.2）increased，and reached maximum value after 3 days（241.27U/kg），which were higher than of raw brown rice（115.57U/kg）.In summary，this study achieved a novel technology to activate endogenous phytase activity of germinated brown rice to reduce phytic acid，which provided basic technical data for maintaining their nutritional value.

phytase；germinated brown rice；heat shock treatment；citric acid；response surface analysis

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0202-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.037

2013－11－04

李欣（1980-），女，博士，講師，研究方向：功能食品生物技術(shù)。

廣東省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2009B020312004）。