m iRNA-26a在良、惡性腹水鑒別診斷中的意義

李 曦 何 敏 鄒 兵

北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東深圳518036

m iRNA-26a在良、惡性腹水鑒別診斷中的意義

李 曦 何 敏 鄒 兵▲

北京大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東深圳518036

目的探討miRNA-26a在良、惡性腹水鑒別診斷中的意義。方法收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院2011年9月～2014年3月門診及住院患者60例，包括20例肝硬化腹水患者（肝硬化腹水組），20例結(jié)核性腹水患者（結(jié)核性腹水組），20例惡性腹水患者（惡性腹水組）。采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)并比較各組血清miRNA-26a、甲胎蛋白（AFP）、糖類抗原125（CA125）的表達(dá)。結(jié)果惡性腹水組血清CA125表達(dá)高于結(jié)核性腹水組和肝硬化腹水組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AFP、miRNA-26a在結(jié)核性腹水組及肝硬化腹水組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AFP和miRNA-26a在惡性腹水組患者血清表達(dá)明顯高于結(jié)核性腹水組和肝硬化腹水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論miRNA-26a水平將來有可能有助于良、惡性腹水的鑒別診斷。

m iRNA-26a；肝硬化腹水；結(jié)核性腹水；惡性腹水

在B超、MRI、CT、PET-CT等影像技術(shù)檢查指導(dǎo)下，以及在臨床各種常見生物化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)（如腫瘤標(biāo)志物等）幫助下，腹水患者的診斷準(zhǔn)確性有了顯著性提高。但是臨床上仍有腹水患者診斷不明，有時(shí)候良性和惡性腹水的鑒別診斷仍然較困難，甚至發(fā)生誤診。一小部分患者仍需要借助腹腔鏡腹腔探查或剖腹探查，而這些有創(chuàng)檢查使患者從身體和心理上帶來較多影響。甚至還有極少部分患者在經(jīng)過探查之后最終仍發(fā)生誤診。為了更準(zhǔn)確地明確腹水原因，同時(shí)減少患者痛苦，有必要尋找一種更好的檢測(cè)指標(biāo)，以提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。

microRNA（miRNA）作為非編碼小分子RNA，在人體中，至今已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)超過1000種。它存在各種不同生物物種當(dāng)中。成熟miRNA具有高度的保守性，組織特異性，能參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1]。每種miRNA可能調(diào)節(jié)多種miRNA的表達(dá)，對(duì)蛋白編碼基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡，并與炎癥和各類疾病發(fā)生，發(fā)展等各種過程密切相關(guān)[1-3]。由于miRNA在血清和體液具體較高的穩(wěn)定性，因此可能作為疾病診斷和鑒別診斷的重要指標(biāo)。

為明確miRNA-26a是否有助于腹水鑒別，本研究選取惡性腹水患者作為研究對(duì)象，以肝硬化和結(jié)核性腹水患者作為對(duì)照，檢測(cè)miRNA-26a在患者血清的表達(dá)，探討miRNA-26a在良惡性腹水鑒別中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）2011年9月～2014年3月門診及住院患者，其中結(jié)核性腹水20例（結(jié)核性腹水組），其中男5例，女15例，平均年齡（34.9±7.9）歲；乙肝肝硬化失代償期且有腹水患者20例（肝硬化腹水組），其中男14例，女6例，平均年齡（48.1±10.0）歲；惡性腫瘤所致腹水患者20例（惡性腹水組，包括肝癌8例，胃癌4例，結(jié)腸癌4例，卵巢癌3例，胰腺癌1例），其中男13例，女7例，平均年齡（57.1±14.9）歲。結(jié)核性腹水組患者年齡小于其他兩組（P＜0.05）；肝硬化腹水組、惡性腹水組、結(jié)核性腹水組患者性別等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

①乙肝肝硬化腹水患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：具有慢性乙型病毒性肝炎病史，或伴有門靜脈高壓，肝功能減退表現(xiàn)；影象學(xué)檢查，如CT、B超或MRI檢查支持肝硬化的診斷，排除其他各種原因引起的肝硬化，如酒精性肝硬化、血吸蟲性肝硬化、Wilson病、膽汁淤積性肝硬化等，排除合并其他嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病，如合并心功能衰竭、腎功能衰竭、呼吸功能衰竭、惡性腫瘤等。②結(jié)核性腹水患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者結(jié)核病史、臨床癥狀、體征、腹水常規(guī)和腹水細(xì)胞學(xué)、其他化驗(yàn)結(jié)果，以及參照可能的PPD皮試陽(yáng)性，腹水或痰涂片抗酸染色陽(yáng)性以及影象學(xué)結(jié)果能夠臨床明確診斷的結(jié)核性腹水患者；通過正規(guī)四聯(lián)抗結(jié)核治療2周以上有效；或腹膜病理活檢確診，排除其他原因引起的腹水，排除合并其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病。③惡性腹水患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)符合，且影像學(xué)如B超、CT、MRI、PET-CT提示患者有惡性腫瘤且合并腹水；胃腸鏡、腹腔鏡、腹水細(xì)胞學(xué)或手術(shù)病理確診惡性腫瘤的腹水患者，排除其他嚴(yán)重性器質(zhì)性疾病和其他原因引起的腹水。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集和處理獲得血液標(biāo)本之后，將其靜置，等待血液凝固后析出血清，之后吸取上層液體和抗凝血液樣本，5000 r/min，離心半徑10 cm，離心12 min，提取上清液。

1.3.2 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)血清樣本中甲胎蛋白（AFP），糖類抗原125（CA125）等濃度采用化學(xué)發(fā)光分析法進(jìn)行測(cè)定，由我院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒由天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3.3miRNA26a的檢測(cè)采用常規(guī)qRT-PCR方法檢測(cè)方法，主要包括以下步驟：①總RNA提取，根據(jù)RNA提取試劑盒完成；②總RNA純度和完整性檢測(cè)；③逆轉(zhuǎn)錄；④定量PCR。大致具體過程如下：在采血后的6 h內(nèi)，分別吸取200μL血漿，使用miRcutemiRNA提取試劑盒的操作方法，進(jìn)行miRNA的提取。完成后，吸取11μL的miRNA提取液，37℃反應(yīng)1 h加多聚腺苷酸，然后吸取2μL反應(yīng)液37℃反應(yīng)1 h進(jìn)行cDNA的合成。上述完成后，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢測(cè)miRNA-26a的表達(dá)情況；采用20μL的反應(yīng)體系，每孔加入5μL的cDNA，0.5μL上游引物和下游引物，10μL 2X stbr greenpcrmastermix，6.5μL的雙蒸水。反應(yīng)條件如下：94℃反應(yīng)1 min，94℃反應(yīng)15 s，60℃反應(yīng)30 s退火，72℃反應(yīng)30 s延伸，反應(yīng)進(jìn)行42個(gè)循環(huán)。其中定量PCR用酶（SYBR Green PCR Master Mix）購(gòu)自TOYOBO公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

惡性腹水組血清CA125表達(dá)高于結(jié)核性腹水組和肝硬化腹水組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AFP、miRNA-26a在結(jié)核性腹水組及肝硬化腹水組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AFP和miRNA-26a在惡性腹水組患者血清表達(dá)明顯高于結(jié)核性腹水組和肝硬化腹水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。其中，惡性腹水患者中有8名肝癌患者，如果剔除這些肝癌患者，AFP在各組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

癌性腹水患者血清檢測(cè)提示AFP、CA125高于正常值比例分別為40%、45%；以0.025作為參考值，miRNA-26a高于0.025的比例為45%，在結(jié)核性腹水患者血清中AFP、CA125高于正常值比例分別為0%、55%，miRNA-26a高于0.025的比例為10%；在肝硬化腹水患者血清中，AFP、CA125高于正常值比例分別為15%、50%，miRNA-26a高于0.025的比例為10%。

表1 AFP、CA125、m iRNA-26a在各組血清中表達(dá)情況±s）

表1 AFP、CA125、m iRNA-26a在各組血清中表達(dá)情況±s）

注：與惡性腹水組比較，*P＜0.05；AFP：甲胎蛋白；CA125：糖類抗原125

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3 討論

相對(duì)過去，近年來腹水的診斷變得越來越容易，主要是原因是影像學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，比如CT、MRI、PET-CT等。此外，一些血清和腹水的標(biāo)志物檢測(cè)也對(duì)診斷提供了一些幫助。如果仍無(wú)法明確診斷的，還可以最終采用腹腔鏡等方式探查腹腔，幫助明確診斷。但是即使如此，臨床上仍然有少部分腹水患者診斷不清，部分是因擔(dān)心手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，拒絕腹腔鏡檢查，或因?yàn)樯眢w狀況不佳，無(wú)法承受腹腔鏡檢查，還有極少部分患者即使行腹腔鏡檢查，仍然無(wú)法找到原因。而傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)志物如腫瘤標(biāo)志物等的檢測(cè)，似乎對(duì)此類患者也束手無(wú)策。

在一些研究中認(rèn)為AFP和CA125有助于良、惡性胸腹水的診斷。AFP被多數(shù)研究認(rèn)為是到目前為止原發(fā)性肝細(xì)胞癌的最為靈敏和特性的腫瘤指標(biāo)。CA125是一種高分子質(zhì)量糖類抗原，其被認(rèn)為是婦科腫瘤，特別是卵巢癌的最重要的血清學(xué)標(biāo)志物之一，同時(shí)可在其他多種腫瘤和良性疾病中升[4-6]。本研究觀察到AFP在惡性腹水患者血清中的表達(dá)水平和高于正常值的比例明顯高于良性腹水組（包括結(jié)核性腹水和肝硬化腹水組），提示AFP的確有利于良惡性腹水的診斷，但AFP作為腹水鑒別的標(biāo)志物時(shí)有明顯缺陷，考慮到本研究中肝癌患者高達(dá)8例，如果剔除這些入組的肝癌患者，其他惡性腹水患者AFP水平和升高比例與良性腹水主相比，沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此AFP在研究中是否能幫助腹水的鑒別診斷，可能取決于入組的肝癌患者的比例和數(shù)量。本研究中發(fā)現(xiàn)CA125的表達(dá)水平在惡性腹水患者中較高，但與其他組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可能原因是本次研究中，入組的婦科腫瘤患者比例少有關(guān)，因?yàn)镃A125在婦科腫瘤中升高更為明顯。由此可見，盡管這些腫瘤標(biāo)志物對(duì)診斷有幫助，但似乎幫助有一定限制，因此，有必要尋找一種新的血清學(xué)標(biāo)志物來幫助腹水患者的診斷。

非編碼RNA研究是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近年來，可與人類基因組計(jì)劃相提并論的重大成果之一[1-2]。miRNA是近年新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA的一種，它廣泛存在于真核生物中，在物種之間具有系統(tǒng)進(jìn)化上的高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。它與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)，包括發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、病毒感染和腫瘤發(fā)生和發(fā)展等[2]。miRNA能影響基因表達(dá)的主要機(jī)制是：通過與靶基因的基因非編碼區(qū)特異性的堿基配對(duì)導(dǎo)致其降解或翻譯阻遏，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[2]。

已有研究表明，miRNA與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，miRNA一部分可能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲，另一部分可能參與抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。miRNA將來可能作為一個(gè)腫瘤監(jiān)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)已為多數(shù)人認(rèn)可[7-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-26a在惡性腹水患者血清的表達(dá)明顯高于在結(jié)核性腹水和肝硬化腹水患者，這提示miRNA-26a水平有可能幫助良，惡性腹水的鑒別診斷。盡管關(guān)于miRNA-26a的文獻(xiàn)不多，但它被認(rèn)為是一種與腫瘤密切相關(guān)的非編碼RNA。miRNA-26a可能作為一種腫瘤抑制因子，顯著降低裸鼠在肝腫瘤負(fù)荷。miRNA-26a可以通過依賴和非依賴于細(xì)胞周期蛋白途徑來抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[10]。高表達(dá)的miRNA-26a的乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬（抗腫瘤藥物）反應(yīng)較好[11]。miRNA-26a還可以通用不同途徑EZH2抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)[12]。這些提示miRNA-26a的變化與腫瘤疾病的發(fā)生存在一定相關(guān)性，但miRNA-26a如何參與腫瘤發(fā)生，發(fā)展的機(jī)制仍不明確。

雖然本研究觀察到miRNA-26a在惡性腹水患者血清的表達(dá)有升高，但目前尚不清楚miRNA-26a在惡性腹水患者血清的表達(dá)明顯升高的原因，也不清楚其是否參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。由于缺乏相關(guān)大規(guī)模研究和以及試劑和相關(guān)方法的影響，無(wú)法確定miRNA-26a正常值范圍，尚無(wú)法運(yùn)用于臨床，但是隨著進(jìn)一步研究的深入，聯(lián)合運(yùn)用miRNA-26a和其他腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢查，幫助腹水的鑒別診斷，將成為可能。下一步，將研究良、惡性腹水患者血清miRNA-26a升高的可能機(jī)制。

[1]Guarnieri DJ，DiLeone RJ.MicroRNAs：a new class of gene regulators[J].Ann Med，2008，40（3）：197-208.

[2]Jiang X，Tsitsiou E，Herrick SE，et al.MicroRNAs and the regulation of fibrosis[J].FEBSJ，2010，277（9）：2015-2021.

[3]Baek D，Villen J，Shin C，et al.The impact ofmicroRNAs on protein output[J].Nature，2008，455（7209）：64-71.

[4]李學(xué)文，肖創(chuàng)清.肝硬化患者血清及腹水中CA199，CA125和CA153的臨床意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（24）：188-189.

[5]單國(guó)棟，金恩蕓，楊銘，等.CA125與腺苷脫氨酶在結(jié)核性腹膜炎患者中的臨床意義[J].中華內(nèi)科雜志，2006，45（23）：938-939.

[6]李曦，鄒兵.結(jié)核性腹水和惡性腹水的鑒別[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2010，8（2）：22-23.

[7]Zhang X，Chen C，Wu M，et al.Plasma microRNA profile as a predictor of early virological response to interferon treatment in chronic hepatitis B patients[J].Antivir Ther，2012，17（7）：1243-1253.

[8]Banaudha KK，Verma M.The Role of MicroRNAs in the ManagementofLiverCancer[J].MethodsMolBio，2012，863：241-251.

[9]Fang Y，F(xiàn)angD，Hu J.MicroRNA and its roles in esophageal cancer[J].Med SciMonit，2012，18（3）：22-30.

[10]Chen L，Zheng J，Zhang Y，et al.Tumor-specific expression of microRNA-26a suppresses human hepatocellularcarcinoma growth via cyclin-dependent and-independent pathways[J].Mol Ther，2011，19（8）：1521-1528.

[11]Jansen MP，Reijm EA，Sieuwerts AM，et al.High miR-26a and low CDC2 levels associate with decreased EZH2 expression and with favorable outcome on tamoxifen in metastatic breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2012，133（3）：937-947.

[12]Alajez NM，ShiW，Hui AB，et al.Enhancer of Zeste homolog 2（EZH2）is overexpressed in recurrent nasopharyngeal carcinoma and is regulated by miR-26a，miR-101，andmiR-98[J].Cell Death Dis，2010，1：e85.

Value ofm iRNA-26a level in benign or malignant ascites

LIXi HEMin ZOU Bing▲
Department ofGastroenterology,Peking University Shenzhen Hospital,Guangdong Province,Shenzhen 518036,China

Objective To investigate the value of serum miRNA-26a level in patientswith benign ormalignant ascites. M ethods 60 cases in Peking University Shenzhen Hospital from September 2011 to March 2014 were included and divided into hepatic cirrhosis ascites group with 20 cases,tuberculous ascites group with 20 cases and malignant ascites group with 20 cases.miRNA-26a,AFP,CA125 level in blood serum weremeasured by qRT-PCR.Results The serum CA125 in malignant ascites group was higher than those in hepatic cirrhosis ascites group and tuberculous ascites group,but the differencewas not statistically significant(P＞0.05).The differences of AFP,miRNA-26a between tuberculousascitesgroup and hepatic cirrhosisascitesgroup was notstatistically significant(P＞0.05);the AFP,miRNA-26a in malignant ascites group were all higher than those in hepatic cirrhosis ascites group and tuberculous ascites group, the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Diagnosis of benign ormalignant ascitesmay benefit from themeasurement ofmiRNA-26a level.

miRNA-26a;Hepatic cirrhosis ascites;Tuberculous ascites;Malignant ascites

R442.5

A

1673-7210（2014）08（b）-0051-04

2014-05-03本文編輯：李繼翔）

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)201203003）。

▲通訊作者